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摘要: 用限制性内切酶酶切的方法把人工合成的GFM cry11B基因编码区克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中，构建成重组表达质粒pGC。在大肠杆菌(Escherichia coli )中表达了GST-GFMCry11B融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的21%，其表达产物主要以包涵体的形式存在。对包涵体蛋白进行可溶性处理，用Glutathione Sephrose 4B纯化出GST-Cry11B融合蛋白。Thrombin酶切后得到Cry11B蛋白，将其作为抗原免疫家兔获得了滴度（ELISA）为1∶8000的抗血清，并具有较强的特异性。 相似文献
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棉铃虫核型多角体病毒（HaSNPV）ORF27编码区全长768bp，编码255个氨基酸残基组成的多肽，预计分子量29.5kD。PCR扩增获得该基因，克隆到融合表达载体pGEX-4t-2中，表达蛋白分子量55.5kD，表达量约占细菌总蛋白的9.2%。割胶透析法纯化融合蛋白，免疫家兔制备多克隆抗体。再把该基因插入到转移载体pFastBacHTb，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，构建重组病毒；提取病毒基因组DNA，在Lipofectin介导下转染昆虫细胞Tn-5B1-4。表达蛋白分子量为32kD，表达量约占细胞总蛋白的2.9%。将ORF27在昆虫细胞中表达产物固定，免疫电镜法确定表达蛋白主要存在于细胞的细胞质中。ORF27基因表达及在细胞内定位为其进一步研究提供了基础。 相似文献
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中国野生华东葡萄抗白粉病转录因子VpRFP1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备 总被引：1，自引：0，他引：1
为揭示中国野生华东葡萄抗病转录因子基因在与葡萄白粉病互作过程中的作用机制,本研究以中国野生华东葡萄(Vitis pseudoreticulata W.T.Wang)高抗葡萄白粉病株系白河35-1为材料,接种葡萄白粉病菌(Unicinula necator(Schw.)Burr.)病原菌诱导后7个不同时期的反转录产物为模板,用RT-PCR扩增得到V.pseudoreticulata RING-finger protein1基因(VpRFP1)的开放阅读框1053bp;将其克隆到pMD19-T载体经测序后,亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(Escherichia.coli)BL21;经IPTG诱导表达出64kD的融合蛋白GST-VpRFP1,主要以包涵体表达形式存在;采用电透析法纯化融合蛋白,并以纯化产物免疫新西兰大白兔获得抗血清,Western blot检测免疫-抗原反应良好。本研究结果表明,在27℃、0.1mmol/L的IPTG诱导4h融合蛋白GST-VpRFP1的表达量最大,免疫大白兔获得的抗血清能够用于VpRFP1基因的功能分析。 相似文献
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鸡白介素-2基因在大肠杆菌中表达及多克隆抗体制备* 总被引：3，自引：0，他引：3
将编码鸡(Gallus gallus)白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)蛋白的基因亚克隆到大肠杆菌(Eschetichia coli)原核表达载体pPROEX^HT中，构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α并用IFTG于37℃诱导培养。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的鸡IL-2融合蛋白分子量约为19kD。融合蛋白经薄层扫描发现目的蛋白表达量约占菌体蛋白的30％。包涵体被6mol／L，盐酸胍裂解后，通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-2融合蛋白及其纯化产物免疫家兔，制备兔抗鸡IL-2多克隆抗血清，并用琼脂扩散实验对多克隆抗血清进行鉴定，表明其与纯化的重组鸡IL-2蛋白具有良好的反应性，而且该反应是特异的。 相似文献
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本文以解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株为研究对象,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出编码TasA抑菌基因的全长DNA,并构建pGEX-4T2/TasA原核表达载体,获得TasA-GST融合表达的抑菌蛋白。测序结果表明,解淀粉芽孢杆菌YN-1TasA基因核苷酸序列全长为786bp(GenBank登录号:EU131674),编码261个氨基酸残基;同源性分析表明,它与解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens FZB42(YP_001421886)序列的同源性最高,达98%,预测蛋白分子量为31kD。SDS-PAGE分析表明,TasA基因能在大肠杆菌BL21中表达,Western印迹分析pGEX-4T2/TasA原核表达载体,检测到约57kD的TasA-GST融合外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。表达产物细胞裂解液上清经Ni柱层析,表明浓度为500mmol/L咪唑洗脱缓冲液时获得较高浓度和纯度的纯化蛋白。进一步抑菌活性分析表明表达产物对黄瓜灰霉病病原菌检测平板上显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为今后深入研究TasA抑菌蛋白基因以及抗病转基因工程提供了参考。 相似文献
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根据中国野生葡萄芪合成酶基因cDNA序列(该序列已申请国家发明专利,申请号:200510041662.4),设计1对PCR引物,以野生种华东葡萄(Vitispseudoreticulata)白河-35-15'RACEcDNA第一链为模板,克隆该目的基因。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化EscherichiacoliBL21,经诱导后表达出约66kD的融合蛋白。该融合蛋白主要以包涵体形式表达,经变性剂溶解、梯度透析,对该包涵体进行复性,复性蛋白通过与GlutathioneSepharose4BFastFlow结合、洗脱,获得了纯化的芪合成酶融合蛋白。以洗涤纯化的包涵体作抗原免疫家兔,制备多克隆抗血清,经Westernblot检测,该抗血清(稀释到1∶3000)与芪合成酶融合蛋白识别反应良好。 相似文献
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PCR扩增获得水稻叶绿体Rubisco SSU引导肽基因和水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）外壳蛋白（coat protein，CP）基因。分别借助于pGEX-4T-1和pET-29a表达载体，构建获得了融合基因PR-CP和PR-S-CP。测序鉴定融合基因构建正确后，将重组子pGEX-PR-CP和pET-PR-S-CP转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达后，利用SDS-PAGE电泳和Western blot对表达产物进行了鉴定。结果发现，融合基因表达产物大小与预期结果一致，且能与RSV CP抗体特异结合。说明融合基因中的RSV CP获得了正确表达，在融合蛋白中保持了自身独立的抗原活性，推断融合基因在生物体内的表达可能都能保持每个蛋白各自独立的结构和功能。 相似文献
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PCR扩增获得水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)叶绿体Rubisco SSU引导肽基因和水稻条纹病毒(Rice stripe virusRSV)外壳蛋白(coat protein,CP)基因.分别借助于pGEX-4T-1和pET-29a表达载体,通过两种方法构建了融合基因PR-CP和PR-S-CP.测序表明,其读码框完整,连接部位正确.将重组子pGEX-PR-CP和pET-PR-S-CP转化大肠杆菌(Eschetichia coli)BL21(DE3)并诱导表达.SDS-PAGE电泳检测其表达产物分子量分别为64和40 kD,与预期结果大小一致.Western blot鉴定发现.两种融合基因的表达产物均能与RSVCP抗体特异结合,说明融合蛋白中RSVCP蛋白保持了自身的抗原活性,叶绿体Rubisco SSU引导肽并未影响其正确表达.可以推断两种融合基因PR-CP和PR-S-CP在生物体内表达时,融合蛋白中的Rubisco SSU引导肽和RSV CP蛋白可能都能保持各自独立的结构和功能. 相似文献
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液泡加工酶(VPE)基因是植物内启动和执行细胞程序性死亡的关键基因,β型VPE是种子特异表达并且为种子蛋白成熟所必须的基因.本研究以黑比诺葡萄(Vitis vinifera cv.Pinot Noir)花后8个不同时期胚珠的cDNA混合样为模板,通过RT-PCR扩增得到葡萄β型液泡加工酶基因(暂命名VvβVPE,GenBank登录号:KC136352),开放阅读框1 485 bp.进一步将VvβVPE克隆到pGEX-6P-1原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,经IPTG诱导,获得约81.3 kD的包涵体融合蛋白GST-VvβVPE.将诱导条件优化后,在37℃、0.05 mmol/L IPTG诱导5h后融合蛋白GST-VvβVPE的表达量最大,采用电透析与盐酸胍处理后透析复性两种方法获得纯化包涵体蛋白,电透析纯化法获得纯化包涵体蛋白的浓度可达到免疫要求.使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清,经Western blot检测,该抗血清(稀释到1∶10 000)与GST-VvβVPE融合蛋白识别反应良好,获得的抗血清可用于以后的VvβVPE的酶活性分析、免疫亚细胞定位分析以及转基因植株蛋白水平的鉴定等,为进一步明确VvβVPE在葡萄胚珠发育中的作用提供基础数据. 相似文献
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肠毒素性大肠杆菌mSTⅠ-linker-LTB融合蛋白的表达及免疫保护试验 总被引：1，自引：0，他引：1
用分子生物学方法拼接成肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)mSTⅠ-linker-LTB融合基因,并定向克隆到pET-32α( )中,转化宿主菌(E.coli)BL21(DE3)。重组菌经1mmolLIPTG诱导,在30℃下,5h时表达产物(分子量约为37kD)达到高峰,表达量约占菌体总蛋白30%。表达产物主要存在包涵体中,经Westernblot鉴定呈阳性。乳鼠胃内接种实验证明,融合蛋白无野生型STⅠ的生物毒性。将融合蛋白与矿物油乳化后免疫ICR小鼠,对K88、K99、987P和F41的保护率分别为83.3%、100%、66.7%和66.7%。 相似文献