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为了优化根癌农杆菌介导的棉花下胚轴切段的基因转化体系,以苜蓿抗菌肽基因（alflafa antifungul peptide gene, alfAFP）为目标,利用GUS报告基因和潮霉素抗性基因的检测方法,分析和探讨了根癌农杆菌菌种、菌液浓度、浸染下胚轴的时间、共培养中乙酰丁香酮（AS）的浓度、共培养温度和时间等因子对基因转化的影响。优化分析表明,用农杆菌菌株LBA4404当OD600值为0.5-0.7的菌液浸染5-7日龄的棉花无菌苗下胚轴切段10-15分钟,在含200µmol/L AS的共培养基中21℃暗培养60h可更有效地提高转化率。经上述条件处理的下胚轴在含50mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上培养3周可产生转化率最高的愈伤。愈伤组织经分化培养获得15株再生棉花,经过PCR和southern-PCR分析,发现其中12株含有外源抗病基因alfAFP,可作为棉花抗病育种的种质。 相似文献
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农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立 总被引：3，自引：5，他引：3
为建立农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导高羊茅(Festuca arundinaceaSchreb.)遗传转化体系,以草坪型高羊茅品种凌志的胚性愈伤组织为受体材料,通过gus基因瞬时表达检测,研究了多种因素对农杆菌介导转化的影响。结果表明,农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化的适宜条件为:愈伤组织在含BAP和NAA各0.5mg/L的培养基上预培养3d;菌液浓度OD600值0.7,感染时间15min;农杆菌预培养基和悬浮培养基以及共培养基中添加100μmol/L的乙酰丁香酮;共培养温度23℃,共培养时间3d,共培养基pH值5.2。不同浓度潮霉素筛选效果试验表明,采用低浓度(50mg/L)潮霉素连续筛选,再生获得的转基因植株数最多,因此是最为可取的筛选方式。 相似文献
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黄淮麦区推广品种小偃22农杆菌遗传转化体系的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
小偃22小麦是目前陕西省生产上的主栽品种,在黄淮麦区其他地区也大面积推广种植。本文通过对小偃22小麦胚性愈伤组织的来源﹑生理状态和干燥时间,根癌农杆菌的接种浓度和侵染方式,AS的添加浓度,胚性愈伤组织和根癌农杆菌的共培养温度和共培养时间,潮霉素的筛选浓度和筛选方式等参数进行比较研究,建立了小偃22小麦农杆菌遗传转化体系。结果显示,以来源于幼穗的胚性愈伤组织作为转化受体较为适宜,愈伤组织生理状态为从幼穗直接诱导30d后继代1次并培养15d的胚性愈伤组织,农杆菌侵染前对胚性愈伤组织干燥处理30 min较为适宜;农杆菌菌液浓度为0.8OD,采用抽真空侵染5min＋非真空侵染10min的浸染方式,共培养温度为22℃,共培养时间为72h,AS的适宜添加浓度为150μmol/L;筛选方式选用在抗性愈伤组织筛选阶段经75mg/L潮霉素筛选后,在分化阶段不再进行筛选或采用25mg/L低浓度潮霉素筛选。通过重复转化验证试验和分子生物学鉴定,表明该遗传转化体系具有可行性。 相似文献
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农杆菌介导籼稻转化体系的优化 总被引：3，自引：2，他引：3
以8个籼稻品种作材料,研究了携带抗稻瘟病基因Pi9片段的pCAMBIA1301质粒的根癌农杆菌EHA105转化籼稻幼胚愈伤组织的影响因素。结果表明,NB培养基适用于籼稻愈伤组织的诱导,共培养时间以3d为宜。40mg/L的潮霉素可用于籼稻愈伤组织的筛选,抗性愈伤率在69.4%~85.3%之间;抗性愈伤组织经分化培养,幼苗分化率在15.4%~47.4%;鉴于多数籼稻愈伤组织分化时对潮霉素特别敏感,因此分化培养基中不加潮霉素;但为了减少假阳性,生根培养基中分别用20mg/L和30mg/L的潮霉素对幼苗进行筛选。 相似文献
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以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品种浙双758子叶柄外植体为受体,建立农杆菌介导转化体系,研究乙酰丁香酮、羧苄青霉素浓度和潮霉素筛选浓度等对农杆菌遗传转化效果的影响。结果发现,羧苄青霉素对农杆菌的抑制效果以500mg/L最佳,且对子叶柄外植体愈伤组织诱导和分化的影响最小,愈伤组织诱导率和芽再生率分别为75.2%和65.1%。5.0mg/L的潮霉素能完全抑制未转化再生植株的生长,使其最终褐化死亡,在此潮霉素筛选浓度下,获得了32株转化再生植株。共培养时培养基中添加100μmol/L AS的芽再生率为3.9%,显著高于未添加AS的芽再生率（2.0%）,说明共培养阶段添加酚类物质乙酰丁香酮有利于转化载体T-DNA的转化。部分转化再生植株经PCR和Southern杂交检测呈阳性,病虫害接种试验表明转化植株对菌核病和小菜蛾有较好的抗性。 相似文献
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安祖花(Anthurium andraeanum)是近年来非常流行的年宵花卉之一。为了优化安祖花的遗传转化体系,本研究以安祖花Arizona品种组培苗的叶片为外植体,将构建好的重组质粒p SN1301-HYG-Ph CHS在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101介导下转化安祖花。优化后的体系为:首先将组培苗幼嫩叶片切块后置于1/3 MS预培养基(附加200 mg/L NH4NO3,0.5mg/L BA,0.05 mg/L 2,4-D,5g/L琼脂,30g/L蔗糖)中预培育3 d,然后用根癌农杆菌(菌液OD600=0.5)侵染10 min,将侵染过的叶片接种于MS培养基,28℃黑暗条件下共培养3 d,之后转移到附加有500 mg/L羧苄青霉素和30 mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基中进行筛选。结果表明,抗性愈伤组织形成率可达到5%~6%。对体系优化过程中获得的14株抗性转基因植株进行PCR检测,其中9株为阳性,证实矮牵牛查尔酮合成酶基因(Petunia hybrida chalcone synthase gene,PhCHS)已经转入安祖花Arizona中。该研究结果为利用转基因方法改良安祖花品种提供了技术保障。 相似文献
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根癌家杆菌介导的玉米遗传转化体系的建立 总被引：47，自引：0，他引：47
用根癌农杆菌菌株LBA4404（pTOK233)转化多种基因型的玉米幼胚。幼胚与农杆菌共培养3d后，检测到了GUS基因的瞬时表达。利用GUS基因的瞬时表达对农杆菌转化玉米的条件进行了优化，共培养后的幼不经含潮霉素的培养基筛选培养两个月后，获得了多种基因型的抗性愈伤组织。其中综3自交系的抗性愈伤组织分化出植株，P9－10、综3自交系R0结实得到后代。Southern杂交分析证实了霉素基因在玉米自交系P9－10基因组中的整合，建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。 相似文献
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本文利用来自质粒pUCATPH的构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的启动子(PtrpC)、终止子(TtrpC)和潮霉素磷酸转移酶抗性基因(hph)以及植物表达载体pROKⅡ成功构建了适用于丝状真菌的根癌农杆菌介导转化的双元载体pROKIIHPH,并转化根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404,建立了根癌农杆菌LBA4404介导的链格孢Alternaria alternata分生孢子转化体系;再从乙酰丁香酮(AS)浓度、不同的共培养时间、受体菌分生孢子浓度和农杆菌菌液浓度对A. alternata转化效率的影响对体系进行优化。结果确定了根癌农杆菌菌液体积为200mL(OD600=0.15),A. alternata分生孢子浓度为106个/mL,在A. tumefaciens的预培养时期以及与A. alternata共培养时期分别加入200μmo1/LAS,共培养时间48h,转化率达120～200个/105分生孢子。在所筛选的约800个转化子中获得了1株毒性明显低于野生菌sd1的弱毒突变株t108,通过PCR验证推测其毒力降低可能由于T-DNA插入阻断了基因的表达。该实验结果为与突变相关基因的研究以及弱毒株t108的进一步研究和利用提供了实验材料,也为深入研究链格孢sd1菌株的基因功能奠定了基础。 相似文献
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以爬行卫矛(Euonymus fortunci var.radicans)无菌苗下胚轴为外植体,在附加不同浓度植物生长调节剂的MS基础培养基上诱导培养,通过器官直接发生途径获得再生植株.结果表明,0.5 mg/LBAP和0.01 mg/L NAA组合的诱导效果最佳,其不定芽再生率高达92%,外植体平均不定芽数目为4.2个.将含有雪花莲凝集素基因(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)的植物表达载体pBCGm导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404,通过农杆菌介导法遗传转化爬行卫矛的下胚轴,经PCR和PCR-Southern检测,GNA基因已整合到转化植株的基因组中.遗传转化过程中,外植体不经预培养,菌液浓度OD=0.6,共培养3 d,有利于获得最高遗传转化效率. 相似文献
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基因芯片是以预先设计的方式将大量的生物讯息密码（寡核苷酸、cDNA、基因组DNA等）固定在玻片、硅片等固相载体上组成的密集分子阵列。基因芯片技术本质是生物信号的平行分析,它利用核酸分子杂交原理,通过荧光标记技术检测杂交亲和与否,再经过计算机分析处理可迅速获得所需信息。由于其具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点,已引起国际国内广泛的关注和重视,在许多领域得到了广泛的应用。本文简述了基因芯片的概念,技术特点及主要分类,着重对其在基因表达水平检测,基因突变和多态性的分析,基因组DNA分析,后基因组学研究以及转基因农作物检测等方面进行阐述,并说明其存在的问题及展望。 相似文献
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GRX基因家族是从原核生物到真核生物中普遍存在的一类巯基-二硫键氧化还原酶,在植物的生长发育、器官构建及逆境胁迫和激素信号应答中均发挥重要作用.本研究在番茄基因组范围内,利用生物信息学方法对番茄的GRX基因组家族的成员、分布及结构和功能等进行分析.预测结果显示,番茄GRX家族包含55个蛋白质,分为4个亚族,其中植物特有的CC亚族成员最多,有35个,其他GRX基因成员与拟南芥GRX家族具有相似分类.在番茄GRX结构域中包含12个重要的基序,主要分布在序列的N端,相同亚族中的GRX成员蛋白序列的氨基酸保守域构成基本一致,且各亚族成员的氨基酸保守域组成特异,表明这些基序的存在对GRX蛋白功能的执行是必需的.利用实时荧光定量PCR对番茄GRX基因的组织表达和胁迫响应分析,结果表明,GRX基因具有组织特异性表达差异,CC型在根和花中表达较高,在果实中表达较低;在盐、SA、ABA、高温和低温胁迫条件下,22个番茄GRX基因的表达模式被阐明;其中部分基因的表达水平被显著地诱导增加或者降低,很可能参与了调控番茄逆境胁迫条件下的防御应答反应.本研究结果将为番茄GRX家族基因的深入研究提供依据,为进一步解析GRX基因功能奠定基础. 相似文献
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本文通过设计引物进行PCR扩增α-法尼烯合酶(AFS)基因的5'端区段并测序,获得510bp的‘国光’苹果AFS基因启动子和5'端非翻译区(5'UTR)序列,已在GenBank注册(登录号FJ263961)。序列分析结果表明,该序列具有典型的启动子特征,在转录起始点上游-46bp处有一个TATA盒,-93bp处有一个CAAT盒,-84bp处有一个W盒和-436bp处有一个热胁迫反应顺式作用元件GAAATTTTTT。与‘皇家嘎拉’苹果的AFS基因启动子序列(GenBank登录号AY786553.1)比对,本研究发现‘国光’苹果AFS基因启动子序列中有6个碱基(-186T,-207T,-283C,-301A,-413A和-433A)发生变异,‘皇家嘎拉’苹果AFS基因启动子序列相应位置的碱基分别为碱基缺失、-206C、-282G、-300G、-412G和-432G。重要的是,其中‘国光’苹果-413A碱基变异为G发生在一个热胁迫反应顺式作用元件GAAATTTTTT中,苹果虎皮病发生和AFS基因的转录表达是否受到这一碱基变异的影响值得进一步探讨。本研究结果还表明,在苹果AFS基因启动子和5'UTR序列中存在一个正向... 相似文献
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十字花科黑腐病菌hpaS影响致病性、HR其编码产物分别与HpaR2、HrpG形成双组分系统。为了深入了解hapS的表达调控机制,本研究将hpaS的启动子与蔗糖敏感基因sacB融合,构建了hpaS的表达报告质粒pL6sacB3670并导入十字花科黑腐病菌野生型菌株8004中,获得了报告菌株8004/pL6sacB3670。然后利用转座子EZ：Tn5对该报告菌株进行诱变,筛选到一株转座子EZ：Tn5插入基因组的克隆。通过测序定位分析发现该克隆是由转座子EZ：Tn5插入到编号为XC_2486的ORF所产生的。然后将hpaS启动子与报告基因gusA融合的报告质粒pL6GUS3670分别导入野生型8004和XC_2486的突变体239C02中,测定比较pL6GUS3670的GUS表达水平,结果显示在突变体背景下GUS表达水平明显比在野生型背景下降低。这表明XC_2486正调控hpaS的表达。对XC_2486突变体239C02进行致病性和过敏反应检测发现,XC_2486与致病性相关,与HR无关。 相似文献
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王友如 《农业生物技术学报》2007,15(6)
将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白（VHb）基因与含有融合杀虫基因（GFMcryIA基因和CPTI基因的融合）表达载体PGBIF4ABC构建成双价基因植物高效表达载体PGBIF4ABCVHB，通过根癌农杆菌介导转化烟草，获得了38株卡那霉素抗性转基因株，经PCR及Southern blotting检测，证实了双价基因在32株转基因烟草基因组中整合。western blot检测证实了VHb基因的表达,杀虫实验表明融合杀虫基因表达出的毒蛋白具有杀虫活性，转基因烟草平均每株干重高于非转基因烟草植株8％。实验结果表明：VHb基因和融合杀虫基因烟草在烟草中的表达既可使烟草既可增产、又具抗虫性。 相似文献
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对含有烟草花叶病毒番茄株系(TMV-L)部分基因组cDNA的克隆进行缺失改造,得到了含有TMV-L运动蛋白(MP)基因的克隆.MP片段分别与组成型启动子CaMV35S和病原特异诱导型启动子CHS、PiⅡ和BG体外重组,构建成植物表达载体p35S-30K,pCHS-30K,pPiⅡ-30K和pBG-30K.通过农杆菌LBA4404介导,分别转化含Tm-22抗性基因的番茄品种Geneva 80.转化p35S-30K的基因工程植株在苗期观察到了部分坏死和黄化现象,初步证明TMV-L MP与Tm-22存在基因对基因的互作关系.诱导型启动子控制下的MP转基因番茄已得到部分潮霉素抗性愈伤组织,为进一步获得广谱高效抗病植株奠定了基础. 相似文献
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本研究采用扩增条件优化的PCR扩增技术,以MDCC-MSB1细胞基因组DNA为模板扩增出鸡端粒酶RNA（chicken telomerase RNA,chTR）全长基因,克隆到pMD18-T载体中,经酶切鉴定和PCR鉴定后测定序列。序列分析表明所克隆的鸡端粒酶RNA基因全长465bp,其中模板区的11个核苷（5＇-CUAACC-CUAAU-3＇）合成端粒亚单位（TTAGGG）n。chTR基因的克隆为进一步研究chTR在马立克氏病发病过程中的作用以及马立克氏病的发病机制提供可能的序列基础。 相似文献
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胸腺肽基因对胡萝卜的遗传转化 总被引：1，自引：0，他引：1
胸腺肽(thymosin)是一种由胸腺分泌的促进淋巴细胞合成和成熟的多肽激素,对于淋巴系统的发育和维持免疫系统的平衡起重要作用(李金屏,1999;张符光和刘佃辛,1996)。市场上广泛使用的胸腺肽主要是从小牛胸腺和猪胸腺中提取制备的。从小牛胸腺和猪胸腺中进行胸腺肽的提取,生产成本 相似文献
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基因融合技术及其应用 总被引：3，自引：0，他引：3
基因融合技术以其快捷、高效生产多功能蛋白的优势，近年来在生物学领域中得到了愈来愈广泛的应用，结合本实验室的相关研究，简要综述基因融合技术、影响基因融合的主要因素以及融合基因的主要应用。 相似文献
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壳聚糖酶基因的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究采用一对引物从巨大芽孢杆菌BS-0409中成功地克隆了壳聚糖酶基因（Csn） 全基因序列,大小为516bp,将其在NCBI网站上用BLAST程序进行在线检索分析,结果与多种芽孢杆菌同源性均为96%。同时,利用DNAMAN软件比较巨大芽孢杆菌BS-0409与其它13种不同细菌Csn编码基因的氨基酸序列,结果显示不同细菌Csn氨基酸序列之间有比较高的同源性,且与多种芽孢杆菌具有较高的同源性。 相似文献