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1.
为了建立柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)基因组长链RT-PCR扩增体系,构建其全长cDNA克隆,为深入了解CYVCV分子特性及其致病机理奠定基础。根据GenBank中CYVCV基因组序列和5′RACE扩增结果设计引物。以感染CYVCV的代代酸橙(Citrus aurantium‘Daidai’)植株总RNA为模板进行长链RT-PCR扩增,得到CYVCV全基因组cDNA,克隆至pGEM-Teasy载体,并进行序列测定与分析。结果显示,建立了一步扩增CYVCV全基因组的长链RT-PCR方法,扩增出约7.5 kb的目标片段;所获得的4个CYVCV全基因组cDNA序列与GenBank中已登录的相关毒株的核苷酸序列同源性为93%~99%。 相似文献
2.
不同类型柑橘中黄脉病毒衣壳蛋白基因的保守性及复制水平 总被引：1，自引：0，他引：1
为研究不同柑橘品种对柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)变异的影响,将CYVCV毒株CQ01嫁接接种于4类共35个柑橘品种,对不同植株中CYVCV的衣壳蛋白(CP)基因进行分析,结果发现仅有少数位点发生了变异。运用RT-qPCR技术检测不同柑橘品种中CYVCV的相对含量,发现甜橙类品种中CYVCV的相对含量最高,墨西哥来檬中CYVCV的相对含量最低。植株中CYVCV的含量与其症状不存在明显的关联。 相似文献
3.
选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。 相似文献
4.
中国柑橘叶斑驳病毒和碎叶病毒发生状况及其分子特性研究 总被引：2，自引：0，他引：2
柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)和柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)均可侵染柑橘的不同种。为明确CLBV及CTLV在中国柑橘上的发生状况和分子特性,采用RT-PCR技术对来源于中国7个省的342份和346份柑橘样品进行检测,检出率分别为9.6%和11.0%。对14个CLBV分离物和15个CTLV分离物的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因部分序列分析显示,CLBV分离物间cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为82.1%~100%和88.1%~100%,CTLV分离物的cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为89.5%~100%和92.5%~100%。测定的14个CLBV分离物在系统进化树中聚为2个组;而CTLV分离物分组不明显,该病毒的系统进化与寄主来源无明显关系。 相似文献
5.
通过柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）兔源多克隆抗体（一抗）及Ap标记羊抗兔IgG（二抗）最佳稀释度等条件优化建立了CYVCV直接组织点免疫（Direct tissue blot immunoassay,DTBIA）检测方法,并对其特异性、稳定性和检测效果进行了评价。试验结果显示,一抗、二抗稀释比例分别为1︰8 000和1︰2 000时,DTBIA检测CYVCV效果最佳;应用所建立的DTBIA方法对携带9种不同柑橘病害的柑橘样品进行检测时,仅携带CYVCV样品呈阳性反应;柑橘黄脉病样品植物组织印迹后,印迹膜于4 ℃保存,90 d内可进行有效的CYVCV检测;对田间不同柑橘品种利用DTBIA法检测CYVCV,其结果与一步法RT-PCR符合率为97.92%。可见,该CYVCV检测方法快速、简便、稳定、特异及可靠,可推广应用于田间快速检测CYVCV,对于防范柑橘黄化脉明病毒大面积传播流行具有重要的现实意义。 相似文献
6.
为更快速准确检测柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）,根据病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异性引物,通过体系优化得到最佳反应条件,建立基于SYBR GreenⅠ的CYVCV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法可特异性检测CYVCV,而测试的柑橘衰退病毒、碎叶病毒等5种柑橘病毒均不能检测出。灵敏度较普通RT-PCR提高了100倍,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率和相关性系数分别为102%和0.999。对田间样品的检测结果表明,建立的实时荧光RT-PCR适用于检测不同柑橘品种中CYVCV的含量。 相似文献
7.
柑橘黄化脉明病毒RT-LAMP检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
柑橘黄脉病由柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）引起,是中国近年来新发生的一种柑橘病害。根据CYVCV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示该方法能特异扩增CYVCV,与其他6种柑橘病原物（柑橘衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒、鳞皮病毒、柑橘裂皮病类病毒、柑橘碎叶病毒和柑橘黄龙病菌）不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍;田间样品的检出率为63.33%,与RT-PCR的结果一致,适用于田间样品的检测。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染CYVCV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。 相似文献
8.
柑橘脉突病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为了快速、灵敏地检测柑橘脉突病毒(Citrus vein enation virus,CVEV),通过设计特异性引物(EVq F4/EVq R4),优化反应条件,建立了CVEV的实时荧光定量RT-PCR检测体系。该方法特异性良好;检测灵敏度比常规RT-PCR高100倍;标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.992,扩增效率101.8%;检测组内和组间变异系数均小于2.85%,重复性较好。利用所建立的实时荧光定量方法对柑橘植株进行检测发现,‘代代酸橙’和‘象山红’植株中CVEV分布不均匀,其中根部病毒滴度最高,分别为162.52和45.32拷贝·ng~(-1) RNA,皮及叶部病毒滴度相对较低。 相似文献
9.
由柑橘黄单胞杆菌致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的柑橘溃疡病严重危害着柑橘产业的健康可持续发展。前期研究表明,CsWRKY22可能是溃疡病感病基因。从‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中克隆了CsWRKY22的两个等位启动子pCsWRKY22-1和pCsWRKY22-2,长度分别为1 428和1406bp。序列分析表明两个等位启动子序列一致性为91.76%。两个等位启动子含有多种参与植物防御反应和生长发育的顺式作用元件,相同元件的数量和位置基本一致,不同的是,在TATA-box下游,pCsWRKY22-1含有2个22 bp长的TA-rich转录增强序列,而pCsWRKY22-2只含有1个。构建CsWRKY22启动子控制GUS报告基因的植物表达载体pC sW RKY22::GUS,并用农杆菌介导法转化‘晚锦橙’,经GFP活性检测和PCR鉴定获得pCsWRKY22-1::GUS和pCsWRKY22-2::GUS转基因植株各8株和4株。GUS组织化学染色、GUS酶活性及定量PCR分析表明,CsWRKY22启动子具有较强的机械伤诱导活性和柑橘溃疡病病原菌诱导活性,同时具有一定水平的基础表达特性。pCsWRKY22-1机械伤诱导活性高于pCsWRKY22-2,而pCsWRKY22-2溃疡病菌诱导活性高于pCsWRKY22-1。 相似文献
10.
柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)是一种正义单链RNA病毒。其基因组含有6个开放阅读框(ORF),其中ORF2、ORF3和ORF4组成了三基因连锁结构(triple gene block,TGB)。以感染CYVCV的尤力克柠檬[Citrus limon(L.)Burm.f.]植株的总RNA为模板,扩增和克隆了CYVCV的TGB基因,并开展了其编码蛋白的理化性质和分子特性等生物信息学分析;进而通过In-Fusion~?技术构建了TGB各基因的亚细胞定位载体,经农杆菌介导转化洋葱表皮细胞并在荧光显微镜下进行亚细胞定位观察。生物信息学分析结果表明,CYVCV-TGB具有与Potexvirus属病毒TGB相似的理化性质和分子特性,可能参与病毒在寄主中的运动且需要外壳蛋白的参与。亚细胞定位结果显示,TGBp1定位于细胞壁(膜)上,TGBp2和TGBp3主要定位于细胞壁(膜),少量呈星点状定位于细胞内。研究结果为揭示CYVCV在寄主中的运动机理奠定了基础。 相似文献
11.
在山东泰安采集到两个表现黄花叶症状的丝瓜和南瓜样品中检测到小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV);通过RT-PCR和RACE方法获得了两个分离物的全基因组序列,分别命名为CN:Cm:17(丝瓜分离物)和CN:Lc:17(南瓜分离物)。结果表明,CN:Cm:17和CN:Lc:17基因组除Poly(A)尾巴外,分别含有9 593和9 591个核苷酸(Nucleotides,nt),通过多聚蛋白策略编码一个含3080个氨基酸的多聚蛋白。CN:Cm:17和CN:Lc:17在氨基酸水平上一致率为96.7%;CN:Cm:17与韩国分离物KR:RDA:07的氨基酸一致率最高(97.8%); CN:Lc:17与CN:CJLX30535:14和CN:spider131932:13的一致率最高(98.4%)。重组分析发现,CN:Lc:17具有显著重组事件,为KR:KR-PA:05和CN:Cm:17的重组体。基于多聚蛋白编码序列的系统进化聚类结果显示分组与分离物的地理起源存在密切相关性,所有中国分离物分别聚集在A-Ⅴ和A-Ⅵ亚组。 相似文献
12.
运用转录组测序和RT-PCR方法克隆测定了柑橘鳞皮病毒（Citrus psorosis virus,CPsV）3个分离物CHN-1、CHN-2和CHN-3的全基因组。序列分析结果表明,CHN-1、CHN-2和CHN-3的基因组全长分别为11 282、11 279和11 278 nt,均包含4个开放阅读框。CHN-1、CHN-2和CHN-3之间的核苷酸相似性为93.48% ~ 95.98%,编码氨基酸相似性为98.18% ~ 98.86%;与6个已知国外CPsV分离物的外壳蛋白基因核苷酸序列相似性为85.83% ~ 95.23%,其对应氨基酸序列相似性为94.09% ~ 99.32%。系统进化分析显示CHN-1、CHN-2和CHN-3与地中海沿岸国家的CPsV分离物聚为一簇,可能具有共同的起源。 相似文献