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绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于海洋生物多管水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的一种功能独特的生物发光蛋白。能够自身催化形成生色团并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光,能在活细胞内稳定表达。随着进一步对绿色荧光蛋白结构及其发光特性的研究,以及对绿色荧光蛋白基因的成功克隆,对多种新型绿色荧光蛋白的成功改造,使对多种目标进行实时监测成为可能。文中综述了绿色荧光蛋白的发展过程、改进及应用的研究进展。 相似文献
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将绿色荧光蛋白基因编码区克隆到转移载体pBacPAK8,与杆状病毒BacPAK6共转染昆虫细胞,通过同源重组和筛选,构建了整合有绿色荧光蛋白基因的重组病毒。在昆虫细胞中表达的绿色荧光蛋白,在荧光显微镜下呈现绿光。这样,就可在细胞内通过监测其表达情况,以了解病毒在不同细胞中的感染情况。 相似文献
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应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组乳酸杆菌．将pGFP2质粒中的绿色荧光蛋白基因切下,克隆进表达载体质粒pThioHisB的NcoⅠ和SacⅠ位点之间,构建成重组表达质粒pThaioGFP,然后转化大肠杆菌B121．从BL21中提取重组质粒,用电击法转化乳酸杆菌Lac1001,当细菌处于D600nm为0．6的生长期时,使用PEB作为电击缓冲液,对100μL体积的细胞悬液在电容25μF,电阻200Ω,电压2．2kV的电击条件进行完整质粒转化可得到较高的转化率．电击转化后Lacl001于LB培养基上呈绿色,在荧光透射仪下观察,整个菌体发绿色荧光．构建的重组乳酸杆菌能够稳定表达绿色荧光蛋白． 相似文献
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内含肽介导的绿色荧光蛋白纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
利用来源于蓝细菌Synechocystis sp.PCC6803的DnaB内含肽的剪切特性,纯化绿色荧光蛋白.在大肠杆菌中将内含肽与绿色荧光蛋白融合表达,绿色荧光蛋白融合于DnaB内含肤的C端,在20℃,pH 7.0的条件下诱导DnaB内含肤的自剪切发生,利用几丁质亲和柱纯化到无素和标签的绿色荧光蛋白,得到蛋白有较高的... 相似文献
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在研究水稻基因OsWAK1功能的过程中,利用荧光分子标记的方法,将OsWAK1与绿色荧光蛋白GFP构建为融合蛋白,利用注射法使表达OsWAK1::GFP融合蛋白的农杆菌浸入烟草叶片.通过荧光显微观察.根据烟草叶片表皮细胞中是否产生绿色荧光来判断融合蛋白是否表达.研究中同时利用了3个不同的烟草品种,利用同样的方法和操作程序,但是最后根据烟草叶片中绿色荧光的检测结果发现,不同的烟草品种对OswAK1::GFP融合蛋白的表达差异很大.OsWAK1::GFP融合蛋白能够在心叶烟叶片中表达,却未能检测到其在本生烟和三生烟两个品种的叶片中表达. 相似文献
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表达绿色荧光蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。用EcorⅠ和NcoⅠ将pEGFP质粒中的绿色荧光蛋白基因EGFP切下，克隆进表达载体质粒pYA3334的EcorⅠ和NcoⅠ位点之间，构建成重组表达质粒pYAGFP，然后转化大肠杆菌X6212、中间宿主X3730、终末宿主X4550。X4550于LB培养基上呈绿色，在荧光显微镜下观察，整个菌体发绿色荧光。构建的表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌为减毒沙门氏菌活载体基因工程疫苗的研制提供一个良好模型。 相似文献
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应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。用EcoRⅠ和NcoⅠ将pEGFP质粒中的绿色荧光蛋白基因EGFP切下 ,克隆进表达载体质粒pYA3334的EcoRⅠ和NcoⅠ位点之间 ,构建成重组表达质粒pYAGFP ,然后转化大肠杆菌X6 2 12、中间宿主X3730、终末宿主X45 5 0。X45 5 0于LB培养基上呈绿色 ,在荧光显微镜下观察 ,整个菌体发绿色荧光。构建的表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌为减毒沙门氏菌活载体基因工程疫苗的研制提供一个良好模型。 相似文献
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《吉林农业科学》2014,(4):50-53
为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。 相似文献
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试验尝试建立稳定表达外源基因的人成纤维细胞系。取成年男性包皮皮肤的皮下组织,分离培养人皮肤成纤维细胞,分别采用脂质体和慢病毒载体介导转染人皮肤成纤维细胞表达绿色荧光蛋白。结果显示,来自成年人包皮皮下组织的成纤维细胞呈梭形,具有快速的增殖和稳定的生长性能。脂质体介导转染的人皮肤成纤维细胞绿色荧光蛋白表达不稳定,阳性细胞表达率低,转染后的人成纤维细胞变得更为细长,细胞生长速度降低。慢病毒载体介导人皮肤成纤维细胞高效稳定表达绿色荧光蛋白,转染后细胞生长性能和形态没有变化,经过多次传代和冻存复苏对人皮肤成纤维细胞绿色荧光蛋白的表达没有影响,通过流式细胞仪对慢病毒介导表达绿色荧光蛋白的人皮肤成纤维细胞检测显示,绿色荧光蛋白表达阳性率为99.85%,并且表达绿色荧光蛋白的人皮肤成纤维细胞细胞均一程度为76.05%。试验证实了慢病毒载体能够高效稳定介导人皮肤成纤维细胞表达绿色荧光蛋白。 相似文献
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非洲绿猴肾细胞外源绿色荧光蛋白基因表达的RNA干扰 总被引：3，自引：0，他引：3
非洲绿猴肾细胞(Vero)是多种病毒的适应细胞。本研究将外源的绿色荧光蛋白(GFP)基因转染到Veto-E6中,并利用体外转录合成的绿荧光蛋白短双链干扰RNA(siGFP)其表达进行干扰。结果显示：siGFP能有效阻断外源的绿色荧光蛋白基因在Vero-E6细胞中的表达,而不相关的siRNA则对绿荧光蛋白基因的表达没有影响。这为利用RNAi技术在Vero-E6细胞中,抑制外源基因的表达以及通过RNAi技术进行抗病毒的研究奠定了一定的基础。 相似文献
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为探明担子菌糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)中是否存在与构巢曲霉相似的乙醇代谢调控机制,及能否在糙皮侧耳中应用构巢曲霉alc基因开关系统调控表达外源基因,从糙皮侧耳PC15v2.0基因组数据库中电子克隆得到其假拟乙醇脱氢酶基因(alcA)及其上游序列,该基因上游1 317bp序列中含有1个正向和2个反向调控因子AlcR蛋白的特异性结合位点序列。将构建的含有alcA基因启动子控制绿色荧光蛋白基因表达的质粒pEGFP-C1-PalcA转入糙皮侧耳天达300中,转化子在含有葡萄糖的培养基中没有绿色荧光蛋白表达,在含有乙醇的培养基中则有绿色荧光蛋白表达。综合上述,糙皮侧耳的乙醇代谢调控机制与构巢曲霉相似,仅用构巢曲霉的alcA基因启动子替代目的基因的启动子即可在糙皮侧耳中有效调控目的基因的表达。 相似文献
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[目的]构建拮抗菌B96-Ⅱ的启动子文库,为B96-Ⅱ的绿色荧光蛋白标记提供试验基础。[方法]提取拮抗菌B96-Ⅱ的基因组DNA,以绿色荧光蛋白基因（gfp）为报告基因,以启动子探针pNW33N-gfp为载体,通过鸟枪法在E.coliDH5α中构建B96-Ⅱ的启动子文库。[结果]通过筛选获得了21个阳性克隆,编号为P1~P21,这些阳性克隆在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光。研究表明,在热激时间为90 s、用4μl酶连产物原液进行转化时,所得转化子数量最多,平均每平皿可得到167个转化子。[结论]表达绿色荧光蛋白的B96-Ⅱ启动子文库的成功构建为拮抗菌B96-Ⅱ的绿色荧光蛋白标记和环境行为研究奠定了良好的基础。 相似文献
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人血管内皮生长因子和端粒酶催化亚基复合调控序列的构建及转录活性的研究 总被引：1，自引：1，他引：0
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《江苏农业科学》2016,(6)
以建立小球藻(沙漠小球藻)表达系统为目的,为利用小球藻重组表达外源蛋白,以及GFP荧光特性研究沙漠中的小球藻生理及理化性质提供基础方法;同时也探索植物表达载体p CAMBIA2300-35S-OCS能否在沙漠小球藻中表达。通过菌落PCR验证E.coli DH5α是否含有目的基因(GFP基因)的重组植物表达载体p CAMBIA2300-35S-GFP-OCS,然后从E.coli DH5α中提取也构建完成的重组植物表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS;利用电转化的方法将重组植物表达载体p CAMBIA2300-35S-GFP-OCS转入到小球藻细胞中;将电转的小球藻在含有100 mg/L卡那霉素的BBM固体培养基中筛选出单克隆,将单克隆在含有15 mg/L卡那霉素的BBM液体培养基中扩大培养,然后利用PCR和RT-PCR预测绿色荧光蛋白基因(GFP基因)的存在与否和表达情况,再利用SDS-PAGE和荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况。通过SDS-PAGE和荧光倒置显微镜观察结果表明绿色荧光蛋白(GFP)在小球藻中表达成功。试验结果表明重组植物表达pCAMBIA2300-35S-OCS能够在小球藻中表达外源蛋白,以及利用GFP的荧光特性研究小球藻的生理生化差异;也为小球藻在沙漠环境上的应用提供基础。 相似文献
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利用pEGFP-C3作为载体,构建与绿色荧光蛋白基因相连的泛素结合酶UFC1(ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1)序列的真核表达质粒,观察其在真核细胞中的表达和定位,为进一步研究UFC1基因功能打下了基础。采用RT-PCR方法从宫颈癌Hela细胞中扩增UFC1基因全长cDNA,双酶切后克隆到真核表达载体pEGFP-C3中,构建并鉴定pEGFP-C3-UFC1质粒。经脂质体介导转染Hela细胞后,在荧光显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况。双酶切鉴定和测序分析均证实,已成功构建pEGFP-C3-UFC1重组载体。重组载体转染Hela细胞,观察到绿色荧光蛋白表达,还可见绿色荧光呈点状分布于细胞质中;而对照pEGFP-C3质粒转染Hela细胞,绿色荧光蛋白则呈弥散状分布。成功克隆了UFC1基因,构建了pEGFP-C3-UFC1重组质粒。 相似文献