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1.
SRY基因是哺乳动物性别分化与控制的主导基因,参与有序的、多层次调控性别分化和控制的过程。本研究从牛血中提取总RNA,设计特异性引物,利用RT-PCR技术扩增出SRY基因HMG box基因片段,将该片段与pMD18-T载体连接并转化到大肠杆菌(E.coliTop)10中,提取质粒并用EcoRⅠ、AvrⅡ酶消化,将消化后的目的基因纯化并回收,与经同样的酶消化后并纯化回收的载体pPIC9K连接并转化到E.coliTop10,获得重组表达质粒pPIC9K-SRYHMG box,经PCR、酶切、测序验证了此载体构建成功,为下一步使用毕赤酵母表达SRY蛋白打下基础。 相似文献
2.
SRY基因是哺乳动物性别分化与控制的主导基因,参与有序的、多层次调控性别分化和控制的过程.本研究从牛血中提取总RNA,设计特异性引物,利用RT-PCR技术扩增出SRY基因HMG box基因片段,将该片段与pMD18-T载体连接并转化到大肠杆菌(E.coli Top)10中,提取质粒并用EcoRⅠ、AvrⅡ酶消化,将消化后的目的基因纯化并回收,与经同样的酶消化后并纯化回收的载体pPIC9K连接并转化到E.coliTop10,获得重组表达质粒pPIC9K-SRYHMG box,经PCR、酶切、测序验证了此载体构建成功,为下一步使用毕赤酵母表达SRY蛋白打下基础. 相似文献
3.
用真核表达引物从pGEM-IL-2重组质粒中扩增出猪IL-2基因，将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E．coli的JM109中，得到了猪pPIC9K-IL-2重组表达质粒。通过电激法将经SalⅠ酶切线性化的pPIC9K-IL-2质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中，利用甲醇诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析，表明在摇床水平及发酵罐中均表达出约17ku大小的分泌性目的蛋白，采用Sephadex G-100分子筛层析对其表达产物进行纯化，纯化结果理想。 相似文献
4.
根据GenBank已公布的传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列,设计1对IBV S1基因表达片段的PCR引物,用RT-PCR方法扩增出长度为1 566 bp IBV S1基因表达片段,5′端不含信号肽序列,3′端添加了终止密码子。用限制性内切酶SnaB和Not将S1基因和载体pPIC9K酶切回收后连接,构建了重组表达载体pPIC9K-S1。用限制性内切酶Bgl将表达质粒pPIC9K-S1线性化,然后用电转化的方法导入毕赤酵母GS115,在MD平板上生长的转化子经过PCR鉴定和表型筛选后,获得了整合型阳性重组菌株GS115/pPIC9K-S1 His Muts。将重组菌株在1%甲醇中进行诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,IBV S1基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的分子量约为76 000,能与IBV阳性血清特异性结合,表达的蛋白占上清中总蛋白量的12.5%。 相似文献
5.
羊泰勒虫主要表面蛋白P32基因的克隆及真核表达载体的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
提取羊泰勒虫裂殖子总RNA,用特异性引物扩增出其主要表面蛋白P32基因,并成功地将该基因纯化后克隆到pGEM-T Easy 载体上,经PCR 和EcoRⅠ酶切鉴定均为阳性的重组质粒进行了测序和分析.随后将该基因从克隆载体上双酶切,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-MPSP-P32,转化大肠埃希菌JM109,经测序证实,基因序列完全正确. 相似文献
6.
SLC10是以反式剪切引导序列为基础,通过RT-PCR从猪囊尾蚴中克隆到的一个未知基因。将猪囊尾蚴SLC10基因从重组克隆载体pGEM-SLC10扩增并酶切后,与相应酶切处理的毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-SLC10,转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切和测序鉴定,基因序列完全正确。纯化的重组质粒pPIC9K—SLC10用内切酶Sac I线性化,电转化毕赤酵母,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合;采用G418抗性梯度法筛选多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达;通过SDS-PAGE和Western—blot分析表达产物,结果表明目的蛋白得到了表达,但不具有免疫反应性。 相似文献
7.
为了克隆巴什拜羊SPLUNC1基因并表达该蛋白,本试验从巴什拜羊肺脏组织中提取总RNA,利用RTPCR方法扩增出SPLUNC1基因开放阅读框序列,将该基因片段插入到真核表达质粒pPIC9K中构建pPIC9K-SPLUNC1重组质粒,然后将pPIC9K-SPLUNC1重组质粒线性化并电击转化入毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导蛋白表达后用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定目的蛋白。结果表明,经RT-PCR扩增成功获得大小为748bp的SPLUNC1基因;构建的pPIC9K-SPLUNC1重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE及Western blotting检测鉴定结果表明获得大小为25.53ku的SPLUNC1蛋白。本试验结果为进一步研究巴什拜羊SPLUNC1蛋白的生物学活性奠定基础。 相似文献
8.
为探索层粘连蛋白G结构域在甲醇型酵母（Pichia Yeast）中的表达，用PCR的方法获得了鼠层粘蛋白α5链G结构域的E3（LG4-5）和E8（LG1-3）基因片段，并将其克隆到P．pastoris分泌型表达载体pPIC9中，构建了pPIC9-E3和pPIC9-E8等2个毕赤酵母重组质粒。将测序正确的质粒用电转化的方法转化酵母表达受体菌GS115。通过表型和PCR的方法筛选出P.pastoris重组子。用甲醇诱导表达后．进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果表明，鼠层粘蛋白α5链G结构域的E3和E8片段在毕赤酵母中获得了成功的表达。 相似文献
9.
利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫（Orientobilharzia turkestanicum）成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因（TPI），鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接，构建重组表达质粒pPIC9k-TPI，并将其电击转化到毕赤酵母GS115中，重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白，经SDS-PAGE、Western-blotting检测，并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示，成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。 相似文献
10.
为了克隆巴什拜羊SPLUNC1基因并表达该蛋白,本试验从巴什拜羊肺脏组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增出SPLUNC1基因开放阅读框序列,将该基因片段插入到真核表达质粒pPIC9K中构建pPIC9K-SPLUNC1重组质粒,然后将pPIC9K-SPLUNC1重组质粒线性化并电击转化入毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导蛋白表达后用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定目的蛋白。结果表明,经RT-PCR扩增成功获得大小为748 bp的SPLUNC1基因;构建的pPIC9K-SPLUNC1重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE及Western blotting检测鉴定结果表明获得大小为25.53 ku的SPLUNC1蛋白。本试验结果为进一步研究巴什拜羊SPLUNC1蛋白的生物学活性奠定基础。 相似文献
11.
12.
为了在毕赤酵母中表达猪髓样分化因子88因子．我们采用RT—PCR从猪肠系膜淋巴结组织中扩增MyD88全基因,并将其克隆到T载体中,测序验证。将目的基因编码序列插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组质粒,并转化毕赤酵母。重组酵母以PCR验证,表达的重组蛋白用HisTrapTMHP柱纯化后用SDS—PAGE进行分析。结果：构建了重组表达质粒pPIC9K—pMyD88,诱导表达蛋白经纯化后SDS—PAGE分析显示,在相对分子质量（M）约34kD处出现1条特异性蛋白带．说明MyD88在毕赤酵母中获得表达。 相似文献
13.
口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因在毕赤酵母中的表达 总被引：4，自引：0，他引：4
以口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)RNA聚合酶基因3D为研究对象，对其部分碱基进行定点诱变，替换成在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。改造后的目的片段用NotⅠ和AvrⅡ内切酶双酶切，然后与相应内切酶双酶切的穿梭载体pPIC9K相连接，构建重组表达载体pPIC9K／3D，转化大肠埃希氏菌JM109，筛选阳性克隆pPIC9K／3D。经测序表明，插入位置、突变碱基、片段大小和读码框均正确。重组质粒用SacⅠ内切酶线化，电转化毕赤酵母SMD1168，采用G418抗性梯度法筛选，获得高拷贝整合重组菌株SMD1168／pPIC9K／3DHIS^ MUT^ ，利用甲醇进行诱导分泌表达，经SDS-PAGE和Western blotting鉴定，3D基因在毕赤酵母中表达成功，目的蛋白分子质量大小为52ku，与预期的大小吻合，并能够被FMDV阳性血清所识别，表达量占总分泌蛋白量的36％。 相似文献
14.
将番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC基因插入到酵母表达载体pPIC9K内,转化大肠杆菌TG1,挑取阳性克隆,获得酵母表达重组质粒pPIC9K-σC。用DraⅠ酶切线性化重组表达质粒pPIC9K-σC和对照质粒pPIC9K,电转化至甲醇酵母GS115感受态细胞内,经G418抗性筛选和PCR鉴定,获得了2株pPIC9K-σC酵母阳性整合子和2株pPIC9K空载体对照酵母阳性整合子。分别挑取1株进行甲醇诱导表达,SDS-PAGE检测发现pPIC9K-σC酵母整合子在不同时段的诱导表达上清液中均有可见的目的蛋白条带,分子质量与预计大小相符,而对照pPIC9K酵母整合子的诱导表达上清液中没有相应的蛋白条带。说明番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC基因真核甲醇酵母表达体系构建成功,目的σC蛋白在酵母中能够有效地分泌表达。 相似文献
15.
《中国兽医学报》2020,(5)
为表达鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)河北株EtMIC-2蛋白,本试验采用RT-PCR方法克隆出E.tenella河北株EtMIC-2基因,连接到毕赤酵母分泌表达载体pPIC9中,构建重组表达载体pPIC9-EtMIC-2。将其线化后转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达,饱和硫酸铵4℃沉淀浓缩后,用His选择镍-亲和层析柱纯化EtMIC-2蛋白。采用SDS-PAGE和Western blot方法验证其蛋白的表达。结果表明,构建的重组表达载体pPIC9-EtMIC-2在毕赤酵母菌中表达出相对分子质量约为45 000的目的蛋白,表达的EtMIC-2蛋白能被E.tenella阳性血清识别,具有良好的免疫反应原性。为进一步研究EtMIC-2蛋白功能及构建DNA疫苗奠定基础。 相似文献
16.
《中国兽医学报》2019,(11):2173-2178
为研究HB株柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)AMA-1基因的免疫原性,根据GenBank收录的AMA-1基因序列设计了1对引物,对HB株E.tenella的AMA-1基因进行克隆,应用生物信息学分析软件预测AMA-1基因的核苷酸及编码的蛋白质的结构和功能。连接pPIC9载体,并与细胞因子IL-2串联,构建真核表达载体pPIC9-IL-2-AMA-1,转化毕赤酵母细胞GS115,进行蛋白表达及纯化验证。结果显示,HB株E.tenella AMA-1基因全长为1 617 bp,编码535个氨基酸,具有跨膜区及信号肽。经酶切和测序鉴定表明,真核表达载体pPIC9-IL-2-AMA-1构建成功。毕赤酵母转化结果表明,成功将重组载体转化到毕赤酵母中,PCR鉴定得到2 200,2 100 bp 2条带。Western blot检测结果表明AMA-1在毕赤酵母中得到了很好的表达。本试验结果为AMA-1基因的功能和核酸疫苗的研制提供依据。 相似文献
17.
貂源犬瘟热病毒f基因酵母表达载体的构建和鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中登录的犬瘟热病毒f基因序列设计一对引物,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的f基因,将其插入到克隆载体pMD18-T中,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定后纯化回收,与经同样的酶酶切消化后并纯化回收的载体pPICZaA连接并转化E.coliDH5α,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子,阳性克隆菌经PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定表明目的基因插入位置、方向和阅读框正确。证明pPICZaA-f酵母表达载体构建成功。 相似文献
18.
本试验根据已公布的IBV株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列，去掉由18个氨基酸构成的信号肽后，设计一对IBV S1基因表达片段的PCR引物，利用RT—PCR扩增得到了IBV四川分离株的S1基因片段，将该片段克隆到PMD18-T载体上，通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、菌落PCR鉴定，证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒，测序分析片段长为1566bp，已经成功切除了由18个氨基酸构成的信号肽序列。将该基因亚克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点，并通过菌落PCR、双酶切鉴定了该重组质粒的正确性，IBV S1基因毕赤酵母表达载体的构建为进一步利用毕赤酵母表达IBV S1蛋白提供了基础材料，并对表达产物的免疫原性和禽传染性支气管炎基因亚单位疫苗及特异性诊断抗原的研究打下了基础。 相似文献
19.
将牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea-mucosal disease virus,BVDV)河北分离株HB-bd毒株E2基因去除跨膜区获得sE2基因,将sE2基因克隆入巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中,筛选培养后提取阳性重组质粒,经酶切和PCR鉴定,命名为pPIC9K-sE2。重组质粒pPIC9K-sE2经SalⅠ酶切后,电穿孔导入P.pastorisGS115基因进行整合,使外源基因sE2稳定地整合到P.pastoris染色体中,G418筛选得到阳性高拷贝转化子GS115-pPIC9K-sE2。经甲醇诱导表达后,sE2融合蛋白获得了表达,表达产物经SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA分析,确定其表达的sE2融合蛋白相对分子质量大小为37 000,且具有天然蛋白的抗原特异性。免疫活性研究证明,P.pastoris表达的sE2蛋白能刺激动物产生抗体。 相似文献
20.
将牛病毒性腹泻病毒(BVDV)河北分离株HB-bd毒株E2基因去除跨膜区获得sE2基因,将sE2基因克隆入巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中,筛选培养后提取阳性重组质粒,经酶切和PCR鉴定,命名为pPIC9K-sE2.重组质粒pPIC9K-sE2经Sal Ⅰ酶切线性化,电穿孔导入P.Pastoris GS115基因进行整合,使外源基因sE2稳定地整合到P.Pastoris染色体中,G418筛选得到阳性高拷贝转化子GS115-pPIC9K-sE2.经甲醇诱导表达后,sE2融合蛋白获得了表达,表达产物经SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA分析,确定其表达的sE2融合蛋白相对分子质量大小为37 000,且具有天然蛋白的抗原特异性.免疫原性研究证明P.Pastoris表达的sE2蛋白能刺激动物产生特异抗体. 相似文献