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1.
通过原核表达的方式获得能在多种病原茵表面表达的烯醇化酶（Enolase,Eno）,探索Eno在脑膜炎致病过程中的作用。根据GenBank上公布的基因序列设计Eno特异性引物,通过PCR技术扩增2型猪链球菌（Streptococcussuis serotype2,SS2）的Eno基因序列,克隆到pMD18-T载体,进-步亚克隆到原核表达载体pET28a（＋）,构建重组表达质粒pET28a—Eno,转化入大肠杆菌BL21CodonPlus（DE3）感受态中诱导表达,经镍离子螯合柱纯化后,检测其对体外血脑屏障模型通透性的影响。结果显示,经1mmol／LIPTG诱导5h为最佳诱导条件,目的蛋白约54000,与预期蛋白大小相符合;纯化的蛋白Westernblotting分析表明,其具有较好的免疫原性;Eno可致体外血脑屏障模型通透性增加。结果表明,Eno作为SS2潜在的毒力因子在SS2引起脑膜炎的致病过程中起到重要的作用。 相似文献
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狂犬病病毒BD-06株基质蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究旨在获得抗狂犬病病毒M蛋白的多克隆抗体,为进一步研究M蛋白功能提供材料。本试验以狂犬病病毒BD06毒株为模板克隆M基因序列,将其克隆至原核表达载体pET28a;经酶切和测序鉴定,M蛋白基因序列已正确插入表达载体pET28a;以表达载体pET28a-M转化E.coli Rosetta株,并以0.5 mmol/L IPTG诱导,结果表达出27 ku左右的M蛋白;将诱导表达的蛋白质回收纯化,以纯化的M蛋白多次免疫兔子制备多克隆抗体;Western blotting分析和间接免疫荧光分析结果表明,制得的抗体与病毒能够反应,运用制得的多克隆抗体定位了基质蛋白在感染狂犬病病毒的BHK-21细胞中的位置。结果表明成功制得了抗狂犬病病毒M蛋白的多克隆抗体,为研究狂犬病病毒M蛋白功能奠定了基础。 相似文献
3.
根据GenBank中发表的结核杆菌H37RV的ESAT6基因序列设计1对引物,以热灭活的结核杆菌H37Rv菌悬液为模板,用PCR方法扩增得到EsAT6基因DNA片段.将扩增片段克隆于pGM-T载体中,成功构建克隆载体pGM-T-ESAT6.分别将pET28a-GFP质粒和pGM-T-ESAT6质粒用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切,并将纯化的ESAT6基因亚克隆至pET28a-GFP中,构建原核表达载体pET28a-GFP-ESAT6.将pET28a-GFP-ESAT6转化E.coli BL 21(DE3),经IPTG诱导、SDS-PAGE和Western-blot分析,可见相对分子质量约37 200的外源蛋白带,表明GFP-ESAT6融合基因在大肠杆菌中得到了表达.用Ni-NT、A Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的GFP-ESAT6融合蛋白. 相似文献
4.
根据GenBank已发表的红色原鸡FOXL2基因序列(登录号NM_001012612.1)设计引物,以来航鸡全血为模板,PCR扩增出其基因全长编码区,经BamHⅠ-HindⅢ双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-FOXL2重组原核表达载体.将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)通过0.5 mmol/L IPTG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小大约为37 000,与预期表达蛋白大小一致.Western blotting检测显示该蛋白为His融合蛋白,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白.为进一步探索该基因的生物学功能奠定了基础. 相似文献
5.
为了解杆状病毒基因组中成纤维细胞生长因子基因(fgf)的功能,分离纯化了BmNPV DNA,采用PCR方法获得了BmNPV的fgf基因,并克隆至原核表达载体pET28 a,构建了高效原核表达质粒pET28 af-gf。通过IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE检测证实了在27 kD左右有一特异条带,与预测的蛋白质分子量大小一致,并通过N i2+-NTA离子交换树脂亲和纯化了目的蛋白。同时构建了融合GFP的真核表达载体pCDNA3.1-gfp-fgf,通过脂质体转染进入COS-7细胞进行表达和定位观察。fgf基因产物定位于细胞核。 相似文献
6.
为了研究促黄体激素释放激素(LHRH)介导的TAT蛋白核心肽PTD的跨膜作用,测定目的蛋白的转导效率,试验以pET28a-PTD-GFP质粒为模板,设计含LHRH基因序列的特异性PCR引物,经PCR扩增后双酶切,并克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组质粒并在E.coli BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,超声破碎后进行硫酸铵梯度沉淀,取上清液用Phenyl-HP疏水层析柱和Q阴离子交换层析柱纯化,将纯化后的目的蛋白加到体外培养的HeLa细胞中,观察转导情况,分析目的蛋白浓度对转导效率的影响。结果表明:PCR扩增得到目的基因LHRH-PTD-GFP,并成功构建出重组质粒pET28a-LHRH-PTD-GFP,在E.coli BL21(DE3)感受态细胞中成功诱导表达出目的蛋白,经Phenyl-HP疏水层析柱和Q阴离子交换层析柱成功纯化出目的蛋白,在荧光显微镜下HeLa细胞内显现明显的绿色荧光,经分析转导效率与目的蛋白浓度之间呈正相关,回归系数为0.096 6,决定系数(R~2)为0.937 8。说明LHRH介导的TAT蛋白核心肽PTD具有很好的跨膜特性,转导效率对目的蛋白浓度具有依赖性,在一定浓度范围内随着目的蛋白浓度的增加转导效率增大。 相似文献
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为了实现牛支原体p30蛋白在大肠杆菌中的高效表达,试验根据GenBank发表的p30(登录号为AIA33998.1)基因序列,在不改变p30蛋白氨基酸序列的情况下优化基因序列,全基因合成p30基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建的重组质粒pET28a(+)-p30转化至BL21(DE3)工程菌中进行诱导表达,筛选重组菌pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导表达的最适诱导温度、诱导时间及IPTG诱导浓度,利用His-tag镍柱纯化p30重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L、诱导4 h时,p30蛋白表达量最高;SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后p30蛋白达到了电泳纯,经Western-blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在36 ku处有明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达牛支原体p30重组蛋白。 相似文献
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猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A的克隆和原核表达 总被引：2，自引：1，他引：1
原核表达猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A(catabolite control protein A,ccpA)并进行纯化,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。采用PCR方法,扩增ccpA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21中进行诱导、表达和亲和层析纯化;经Western blotting初步评价ccpA的抗原性。重组原核表达质粒pET-28a-ccpA经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约38000,能被相关抗体所识别。因此,能成功在大肠杆菌中表达猪链球菌2型ccpA,为猪链球菌2型相关调节蛋白的免疫学研究奠定基础。 相似文献
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构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 相似文献