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1.
为构建抗人整合素ανβ3单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面表达,采用PCR方法从整合素ανβ3单抗E10ScFv载体中,扩增重链可变区VH和轻链可变区VL基因.将VH基因与人重链恒定区CH1基因连接,VL基因与人CK基因连接,分别构建了鼠/人嵌合重链FD基因和轻链基因,将其克隆入pComb3,构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,用辅助噬菌体VCSM13超感染,间接ELISA及竞争抑制ELISA检测鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体活性.结果成功构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面展示了可结合人整合素ανβ3抗原的鼠/人嵌合Fab抗体. 相似文献
2.
用重组的PCV2Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,从免疫小鼠脾细胞中提取总RNA,经反转录后,扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap PCR方法将VH基因和VL基因组装成单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB-5E中,并将重组载体转化至感受态大肠杆菌TG1中,获得PCV2Cap蛋白的单链抗体文库,经测定抗体库库容为3.58×106。通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建鼠源PCV2Cap蛋白的噬菌体单链抗体库。4轮生物淘选后,经ELISA方法检测,最终获得3株能与Cap蛋白特异性结合的噬菌体克隆。 相似文献
3.
噬菌体抗体库的构建及抗猪脂肪细胞膜单抗的筛选 总被引：1，自引：0，他引：1
用猪脂肪细胞以免疫删减法免疫小鼠，取其脾细胞，RT-PCR扩增抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，克隆入噬菌粒表达载体pCANTAB5E中，构建单链抗体（ScFv）文库。用猪脂肪细胞，对其进行3轮吸附-洗脱-富集，筛选抗猪脂肪细胞膜单抗。经ELISA检测，51/96克隆具有与猪脂肪细胞结合活性，阳性率为53%，与猪肝细胞则成阴性反应，初步证明了单抗的特异性，为猪脂肪细胞膜单抗的制备提供了一种新的方法。 相似文献
4.
从一个抗脂磷酸聚糖IgM型单克隆抗体细胞的mRNA中经RT-PCR克隆重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),然后将VH、Linker和VL连接成scFv,并克隆到载体pCANTAB-5E,转Escherichia coliTG1感受态细胞,构建了单链抗体库。通过辅助噬菌体M13KO7感染后,使单链抗体展示在噬菌体衣壳蛋白pIII的N端,得到噬菌体展示的抗体库。将抗体库用于"淘洗—富集—扩增"3轮以后,得到针对脂磷酸聚糖特异性的噬菌体抗体。测序结果表明,该scFv的VH基因序列全长390 bp,编码127个氨基酸;VL基因序列全长341 bp,编码113个氨基酸。二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基。 相似文献
5.
以速灭威抗原免疫的小鼠为实验对象,取其脾细胞,RT-PCR扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,重叠延伸PCR拼接单链抗体(ScFv)基因,克隆入噬菌粒表达载体pCANTAB5E并转化大肠杆菌TG1,成功构建了库容约7.6×105的抗速灭威噬菌体ScFv库。对该文库进行了5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选,获得了6个特异性较强的抗速灭威噬菌体ScFv阳性克隆。其研究结果为速灭威特异性抗体的大量制备奠定了一定的基础。 相似文献
6.
7.
用灭活的甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌免疫小鼠后,取出小鼠脾脏提取总RNA,以RT-PCR扩增小鼠抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,以重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将VH和VL拼接成ScFv基因,克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中,转化大肠杆菌E.coli TG1,构建鼠源抗金黄色葡萄天然噬菌体抗体库。研究结果表明,构建的鼠源性抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌抗体库库容为3.2×106,多样性良好,共筛选出8个阳性克隆。说明已成功构建抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌抗体库,为筛选有效治疗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌奠定了基础。 相似文献
8.
从免疫过rSpaA的猪的脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT–PCR技术反转录合成cDNA。设计兼并引物扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段,采用重叠延伸PCR方法,将VH和VL通过Linker连接成重组单链抗体(以下简写为sc Fv)的基因片段。将sc Fv的基因连接至噬菌粒载体p Comb3Xss,将重组载体电转化至宿主菌XL1-Blue,并经辅助噬菌体M13KO7拯救,获得猪源噬菌体单链抗体库,库容约为2.5×106。以rSpaA为靶抗原,经免疫亲和筛选,获得8株特异性较好的阳性克隆。本研究结果可为制备抗红斑丹毒丝菌的重组sc Fv提供新途径,并为猪丹毒的免疫检测和综合防制提供材料基础。 相似文献
9.
【目的】构建鼠源抗柑橘溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体(dsFv)片段基因,原核表达并将其复性为具有免疫活性的dsFv抗体。【方法】采用PCR定点突变的方法构建dsFv重链(VH)及轻链可变区(VL)基因,分别将其连接入表达载体中,于E.coli BL21(DE3)中诱导表达,表达产物溶解后稀释入复性缓冲液中使其重折叠为dsFv抗体并纯化。SDS-PAGE及Western-blot分析表达及复性产物,BIAcore检测dsFv与Xac-LPS的亲和力,ELISA验证dsFv的特异性及稳定性。【结果】测序结果表明在VH的44位和VL的100位成功引入了半胱氨酸突变位点,实现了高效的原核表达,表达产物主要以包涵体的形式存在。SDS-PAGE分析显示VH和VL的大小为23 kD,并将其成功复性,复性后大小为46 kD。BIAcore分析表明dsFv对Xac-LPS保持了很高的亲和力,亲和常数(KD)达到3.40×10-10M。ELISA证明dsFv具有较高的抗原特异性并且热稳定性较scFv提高近20℃。【结论】成功表达并复性了dsFv抗体,为柑橘溃疡病菌的免疫诊断提供了高效优质的重组抗体。 相似文献
10.
以健康未经免疫的斑点叉尾为试验材料,取其新鲜外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增重链Fd和轻链cDNA,以纯化的VH、VL基因为模板,以与VH基因3′-端和VL基因-5′端序列互补的Linker—Primer Mix为引物,将VH、VL随机拼接为ScFv。通过酶切连接,依次将PCR产物插入质粒p3MH相应位点,热激法转化大肠杆菌XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM 13,构建噬菌体单链抗体库。测定库容并酶切鉴定。斑点叉尾天然单链(ScFv)噬菌体抗体库成功构建为进一步筛选特异性抗体及从斑点叉尾病变组织中提取特异性抗原用于免疫治疗奠定了基础。 相似文献
11.
[目的]为减少鼠源单克隆抗体的异源性在犬临床治疗中引起的宿主免疫排斥反应,针对H_3N_2亚型犬流感病毒(CIV),制备具有犬源抗体恒定区基因(Fc)的鼠/犬嵌合抗体。[方法]从产生具有良好中和活性CIV单抗的鼠源杂交瘤细胞株中扩增抗体重链和轻链可变区基因,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得单链抗体基因(scFv)片段,同时从犬外周血单核细胞中扩增得到犬源抗体Fc片段;分别构建单链抗体与嵌合抗体表达载体,通过大肠杆菌表达、纯化后调整蛋白浓度为1 mg·mL~(-1),检测单链抗体与嵌合抗体的ELISA和血凝抑制(HI)效价,并分析其对病毒感染细胞的中和活性。[结果]获得的H_3N_2亚型CIV鼠源scFv的相对分子质量为45×10~3,ELISA及HI效价分别为1∶640(1.56μg·mL~(-1))和1∶160(6.25μg·mL~(-1)),中和效价为1∶160(6.25μg·mL~(-1));鼠/犬嵌合抗体scFv-Fc的相对分子质量为80×10~3,ELISA及HI效价分别为1∶2 560(0.39μg·mL~(-1))和1∶640(1.56μg·mL~(-1)),中和效价为1∶40(25μg·mL~(-1))。[结论]成功制备了H_3N_2亚型CIV鼠/犬嵌合抗体,为犬流感的临床治疗提供了物质基础。 相似文献
12.
旨在构建硫代磷酸酯类杀虫剂单链抗体(ScFv)库,并对其进行初步筛选。采用RT-PCR法从牛血清蛋白(BSA)人工抗原免疫的Balb/C小鼠脾细胞中克隆出VH和VL基因,通过重叠延伸PCR方法将VH和VL基因拼接在一起,构建ScFv基因,与表达载体pCANTAB 5E连接后,在大肠杆菌中诱导表达。采用亲和富集法,经6轮淘筛后用酶联免疫吸附分析(ELISA)测定其活性。得到滴度为2.2×106 pfu/mL噬菌体库,ELISA检测呈阳性。说明成功表达并筛选得到鼠源抗硫代磷酸酯类杀虫剂ScFv抗体库。 相似文献
13.
【目的】筛选能表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)单链抗体(scFv)的原核阳性克隆,并分析scFv抗原结合位点的氨基酸变化。【方法】采用RT-PCR,从IBV疫苗免疫的鸡脾脏RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因。利用重组链延伸反应(SOE-PCR),将linker与VH和VL基因相连构建鸡scFv基因,并将其克隆到原核表达载体pOPE101-XP中,构建重组质粒并转入大肠杆菌表达,间接ELISA筛选原核表达的抗IBVscFv的阳性克隆,对其测序后进行Clustal.W多序列比较,分析scFv骨架区(FR)和互补决定区(CDR)氨基酸序列差异。【结果】筛选到表达IBVscFv的阳性克隆ZL.10和ZL.80;将它们的氨基酸序列与鸡胚系Gemline进行多序列比较,结果显示,ZL.10、ZL.80在CDR中易变异氨基酸占各区氨基酸的比率均在40%以上,其中VH的CDR3达90%,VL的CDR3达60%。此外,ZL.10、ZL.80在VH的CDR3区分别增加5个和7个氨基酸。FR氨基酸变异率较少,且大多均在12%以下,而FR4未发生突变。【结论】通过体外筛选原核表达产物的方法,获得了表达IBVscFv的阳性克隆ZL.10和ZL.80,其VH、VL氨基酸序列中的变异主要发生在各自的CDR,二者VH的CDR3氨基酸序列差异很大,提示这2个scFv阳性克隆针对的是IBV不同的抗原位点。 相似文献
14.
《江苏农业学报》2015,(4)
为利用抗猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)单链抗体基因(ScFv)建立CSFV病原快速检测方法,以抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株总RNA为模板,通过RT-PCR扩增重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),以柔性多肽(Gly4Ser)3为接头(Linker),经重叠延伸反应将VH、VL基因拼接为完整的CSFV-ScFv基因,并进行克隆、测序分析。结果显示,所克隆单链抗体基因全长732 bp,包括363 bp的VH、45 bp的Linker和324 bp的VL,为VH-Linker-VL结构,编码的氨基酸序列含有明确的互补决定区(CDR)和框架区(FR)以及特征性的半胱氨酸残基,并与多种鼠源单链抗体基因高度同源,具有重组功能性鼠源抗体可变区特征。对CSFV-ScFv基因所编码蛋白质三级结构进行预测,显示其形成口袋样形状的空间构象,理论上具有良好的抗原结合活性。表明本研究成功构建了CSFV-ScFv基因。 相似文献
15.
[目的]构建出鼠源抗ICOSL核糖体展示抗体库。[方法]通过RT—PCR从人B淋巴瘤细胞Daudi的总RNA中扩增出ICOSL胞外区基因,并将此基因插入到原核表达载体pET28a中进行表达。以表达纯化的ICOSL蛋白为抗原免疫Balb／c小鼠,取小鼠脾脏提取总RNA,通过RT—PCR扩增小鼠的重链可变区和Linker（VH—linker）序列,以及轻链可变区和Linker（VK—linker）序列。经重组PCR将两段基因连接起来,将VH／K与pMD19一T载体链接产物转化E．coliDH50L,PCR鉴定并测序。[结果]VH和κ链得到正确的扩增,长度分别为421和689bp,V14／κ连接产物正确,连接产物长度为1079bp。[结论]所采用的引物及反应条件能够扩增出目的基因,成功构建了鼠源抗ICOSL核糖体展示抗体库,为进行核糖体展示体外筛选抗IcosL特异性单链抗体奠定基础。 相似文献
16.
采用RT-PCR方法成功克隆出抗磺胺二甲嘧啶（SM2）单抗的杂交瘤细胞中396 bp的VH和339 bp的VL可变区基因,再通过重叠延伸PCR方法,由引入的（Gly4Ser）3柔性肽体外组装抗717bp的SM2-ScFv基因。测序经NCBI Blast比较分析和Expasy预测分析。结果表明：所得ScFv具有重组功能性鼠抗体可变区基因的特征,单链抗体的结构符合抗体可变区的功能区的框架区和可变区的结构特点,是抗磺胺二甲嘧啶的可变区基因,且经lingker连接后为影响轻重链的结构。 相似文献
17.
【目的】合成、克隆HIV单克降抗体VRC01的单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。【方法】根据GenBank上公布的VRC01抗体可变区的氨基酸序列合成引物,运用基因从头合成和重叠延伸PCR方法,克隆抗体VRC01的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因;用15肽Linker(Gly4Ser)3将VH和VL基因相连,得到单链抗体基因scFv-VH-Linker-VL和scFv-VL-Linker-VH,并分别将两者克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组质粒后转入大肠杆菌BL21(DE3+)中诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析;将重组蛋白进行变性处理后,利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达产物进行初步纯化。【结果】得到了VRC01的2种单链抗体的基因scFv-VH-Linker-VL和scFv-VL-Linker-VH,其大小分别为770和768bp。SDS-PAGE电泳结果显示,scFv-VH-Linker-VL在大肠杆菌中不表达或表达量极低;而scFv-VL-Linker-VH表达量较高,蛋白质分子质量约为29ku,且主要以包涵体形式存在。Western blot检测结果证实,scFv-VL-Linker-VH可与His-Tag融合表达,并通过亲和层析法成功纯化获得了该单链抗体。【结论】成功构建、表达并纯化出了VRC01单链抗体,为进一步研究VRC01单链抗体的生物学特性奠定了基础。 相似文献
18.
抗堆型艾美耳球虫子孢子单链抗体的构建及表达 总被引：1，自引：0，他引：1
应用RT-PCR技术,从稳定分泌抗堆型艾美耳球虫子孢子抗原的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞Easp-3G3中扩增出抗体VH和VL基因,通过在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗堆型艾美耳球虫的单链抗体基因,并将其克隆至表达载体pET28a( )载体中进行表达,用Ni-NTA的金属亲和层析法进行纯化,通过SDS-PAGE和ELISA测定其纯度和生物学活性.电泳结果分析表明重组蛋白的相对分子量为32kDa,纯度为94%;ELISA反应结果证明该单链抗体保持了单克隆抗体的生物学特性,并能与堆型艾美耳球虫子孢子抗原发生特异性反应. 相似文献
19.
《江苏农业学报》2017,(1)
构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将重链-Linker和Linker-轻链拼接为完整的ScFv基因,酶切、酶连后,将ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上,经电穿孔导入E.coli TG1感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体展示库。以单克隆菌落数计算库容量大小,通过比对随机挑取的单克隆噬菌体ScFv可变区序列的差异,分析库的多样性。以Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为包被抗原,从库中筛选具有结合活性的ScFv验证库的实用性。经检测,提取的总RNA条带清晰,浓度为2.76μg/μl,扩增的抗体重链基因、轻链基因条带清晰,且2条互补的Linker基因成功添加到重链基因和轻链基因上。经SOE-PCR法扩增,重链-Linker与Linker-轻链成功拼接为ScFv基因。电转化后,经PCR(Polymerase chain reaction)扩增和凝胶电泳检测,证实ScFv基因克隆成功,测得初级噬菌体抗体展示库的库容为3.67×10~8。随机挑取12个单克隆菌种进行测序和比对,证实ScFv基因为鼠源抗体基因,且12个单克隆菌种的ScFv基因可变区均有一定差异,说明ScFv基因具有多样性。以3种Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为抗原,经4轮特异性富集筛选后均获得了具有抗原结合活性的噬菌体ScFv菌种,表明该库的实用性较强。 相似文献
20.
抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体（single chain variable fragment,ScFv）基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础。【方法】利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠,制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体,从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）法构建其单链抗体基因,并克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中,重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。【结果】获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1、2D12B6、3D8A10。成功构建了单链抗体基因ScFv,获得的ScFv基因大小约750 bp,其中重链可变区（VH）基因有360 bp,轻链可变区（VL）基因有342 bp,中间连接肽基因45 bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5 kD的ScFv重组蛋白。【结论】试验获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株,成功构建了ScFv基因,并实现了原核表达,为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质的研究打下了基础。 相似文献