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通过对影响AFLP反应体系主要因素的优化,建立了蜡梅的AFLP反应体系,并筛选出了适宜该体系分析的引物.结果表明,20μL蜡梅AFLP最佳酶切体系为模板600 ng DNA,3 U Pst I和3 U Mse I,在37℃下双酶切2 h;在20μL最佳连接体系中酶切产物为15μL,3 U T4连接酶,0.25μmol.L-1 Pst I接头,2.5μmol.L-1 Mse I接头,1μL 10×T4 Buffer,在22℃下连接10 h;在20μL最佳预扩反应体系中稀释10倍的连接产5μL,2.0mmol.L-1 Mg2+,2 U Taq酶,300μmol.L-1dNTP,0.5μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGA/M+ATC);在20μL最佳选择性扩增反应体系中5μL稀释20倍的预扩增产物,2.0 mmol.L-1的Mg2+,2 U Taq酶,300μmol.L-1 dNTP,0.5μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGA/M+ATC).最后,利用上面的体系筛选出了96对适宜于蜡梅AFLP分析的引物. 相似文献
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《江苏农业科学》2017,(16)
利用梭罗草(Kengyilia thoroldiana)基因组DNA优化并建立的梭罗草扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,简称AFLP)反应体系。预扩增反应体系25μL:连接产物1μL,10×PCR Buffer 2.5μL,d NTP 0.375μL,Mg~(2+)1μL,Taq DNA聚合酶0.5μL,EcoRⅠ预扩引物1μL,MseⅠ预扩引物1.2μL,dd H2O加至25μL;选扩增反应体系25μL:预扩产物(稀释20倍)2.0μL,10×PCR Buffer 2.5μL,d NTP 0.60μL,Mg~(2+)2μL,Taq DNA聚合酶0.1μL,EcoRⅠ选扩引物1.5μL,Mse I选扩引物2.5μL,dd H2O加至25μL。利用优化后的AFLP体系,从梭罗草、大颖草(K.grandiglumis)、疏花以礼草(K.laxiflora)共10份供试材料中筛选出216对选择性扩增引物,从中筛选出38对具有多态性的引物并从中选出6对条带清晰、鉴别效率高的引物,其中E16C4、E4C10的扩增条带中均有梭罗草的特征条带,为梭罗草的种质鉴定及利用提供科学依据。 相似文献
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黄瓜基因组DNA提取及AFLP体系优化研究 总被引：2，自引：1，他引：1
［目的］提取黄瓜基因组DNA,并对AFLP体系进行优化。［方法］以黄瓜嫩叶为材料,利用改进的CTAB法提取高质量的黄瓜叶片总DNA,通过优化酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验条件建立适合黄瓜的AFLP银染体系,得到清晰的黄瓜AFLP指纹图谱。［结果］DNA 模板的质量影响酶切以及后续的连接扩增反应,改良的CTAB 提取法可用于黄瓜AFLP 分析,形成清晰的AFLP 指纹。优化的酶切连接体系为：以37 ℃酶切连接12 h为宜,酶切连接的基因组DNA用量为200 ng,预扩增时Taq酶用量为0.5 U/20 μl体系,预扩增产物稀释40倍作为选择性扩增的模板。在此优化的体系下引物E41M47扩增出清晰的条带。［结论］为黄瓜品种的分子标记和黄瓜品种间亲缘关系等研究奠定了基础。 相似文献
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以豫杂一号泡桐组培苗为材料,通过对影响MSAP反应体系各主要因素的优化,建立了适于泡桐MSAP分析的反应体系.结果表明,最佳酶切体系(25μL)包含300 ng模板DNA,16 U的EcoR I和10 U的HapⅡ(MspI),各双酶切8 h后,80℃失活20 min;最佳连接体系(25μL)是酶切产物20μL,0.16μmol.L-1EcoR I接头,1.6μmol.L-1HapⅡ(MspI)接头,2.5μL 10×T4Buffer,2 U T4连接酶,22℃连接18 h;最佳预扩反应体系(20μL)是5μL稀释10倍的连接产物,100μmol.L-1dNTP,0.5 U Taq酶,EcoR I和HapⅡ(MspI)预扩引物各0.25μmol.L-1,2.5μL 10×PCR Buffer.最佳选择性扩增反应体系(20μL)为5μL稀释30倍预扩增产物,100μmol.L-1 dNTP,0.5 U Taq酶,EcoR I和HapⅡ(MspI)选扩引物各0.3μmol.L-1,2.5μL 10×PCRBuffer.最后,利用优化的体系,筛选出了96对适宜于泡桐MSAP分析的引物. 相似文献
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泡桐AFLP反应体系的建立及引物筛选 总被引：1，自引：1，他引：0
以豫杂一号泡桐为材料,通过对影响AFLP技术体系的各主要因素的研究,建立了适于泡桐AFLP分析的技术体系.结果表明最佳酶切体系(20μL)为500 ng模板DNA,3 U的Pst 1和Mse I,在37℃下双酶切3 h;20μL最佳连接体系中为酶切产物15 μL,0.25 μmol·L-1Pst I接头,2.5 μmol·L-1 Mse I接头,1 μL 10×T4 Buff-er,2 U T4连接酶,22℃连接18 h;20 μL最佳预扩反应体系中5 μL稀释10倍的连接产物,100 μmol·L-1dNTP,2 U Taq酶,250 μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGT/M+AGT),2 μL 10×PCR Buffer.20 μL最佳选择性扩增反应体系中5 μL稀释20倍预扩增产物,100 μmol·L-1dNTP,2 U Taq酶,350 μmol·L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGT/M+AGT),2 μL 10×PCR Buffer.最后,筛选出了97对适宜于泡桐AFLP分析的引物. 相似文献
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黄瓜AFLP反应体系的优化 总被引：2，自引：1，他引：1
对影响AFLP(Amplified fragment length polymorphism)扩增的关键因素进行了摸索,以期获得清晰稳定的黄瓜AFLP反应体系。结果发现,最佳的预扩增体系为:20反应体系中包含0.5 UTaqDNA poly-merase、2.0μL dNTP(2 mmol/L)、1.2μL 25 mmol/L Mg2 、0.6μL 50 ng/μL每种引物、1×PCR Buffer和4μL模板DNA;最优的选择性扩增体系为20μL反应体系中含有1.0 UTaqDNA polymerase、2.0μL dNTP(2 mmol/L)、1.0μL 25 mmol/L Mg2 、1.0μL 50 ng/μL每种引物、3.0μL稀释40倍的预扩增产物和1×PCR Buffer。体系优化后,扩增产物稳定,条带十分清晰,无背景干扰。 相似文献
8.
[目的]该研究旨在初步建立适合于菠菜作物的AFLP反应体系。[方法]运用改良CTAB法提取6份菠菜品种的DNA,对AFLP反应体系中酶切连接、预扩、选扩等实验条件进行了优化分析。[结果]研究结果如下:(1)在PCR仪中酶切的效果比水浴的要好,酶切反应对酶切时间和DNA的浓度要求不敏感。(2)菠菜AFLP预扩选扩体系的反应体积为20μl,Mg2+(25mmol/L)1.2μl,dNTPs(2.5mmol/L)1.6μl,Taq-polymerase(5U/μl)0.2μl最佳。[结论]该研究建立的AFLP反应体系对与菠菜基因组分析时稳定有效的,该技术体系为菠菜品种亲缘关系的AFLP分子标记分析和遗传育种等提供一定的理论基础。 相似文献
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以采自广西、云南和河南等地的紫薇属Lagerstroemia植物紫薇L.indica,南紫薇L.subcostata,福建紫薇L.limii和桂林紫薇L.guilinensis叶片为材料,利用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取叶片基因组DNA,获得了高质量的紫薇叶片DNA,并以其基因组DNA为模板进行了酶切连接,利用酶切连接的产物稀释一定倍数作为预扩增的模板,最后以稀释一定倍数的预扩增产物进行选择性扩增,进行紫薇和南紫薇的AFLP（扩增片段长度多态性）银染反应体系的优化。AFLP体系中每一步反应都设置了不同的反应体系,采用了160对引物作为初选引物,筛选出了10对适合紫薇基因组扩增的引物。结果表明,适宜紫薇基因组扩增的最佳酶切、预扩增和选择性扩增体系为：酶切连接体系1;预扩体系3;选扩体系3,反应体系中Mg2＋质量浓度为1.2×10-6kg.L-1时扩增效果较好。 相似文献
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本文以青稞为材料,对AFLP酶切连接、预扩增、选择性扩增过程进行优化。结果表明,酶切反应条件为DNA模板200 ng、限制性内切酶Eco RI/Mse I 4U、酶切时间4h;连接反应条件为连接温度16℃,T4连接酶3 U,连接时间12 h以上;预扩增反应条件为r Taq聚合酶3 U、dNTP 4 mmol/L、镁离子浓度1.00 mmol/L;选择性扩增反应条件为r Taq聚合酶4 U、d NTP 4 mmol/L、镁离子浓度1.25 mmol/L及预扩产物稀释10倍。利用优化后的AFLP体系,以藏青2000、冬青18这2个供试材料的基因组为模板,从100对引物组合中筛选出10对重复性好、稳定性强、扩增条带清晰、分布均匀、多态性高的引物组合,为青稞种质资源鉴定及遗传多样性分析提供了基础。 相似文献