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1.
小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)作为胚胎干细胞培养的饲养层细胞,受到细胞代次等因素限制,需要长期反复制备,消耗大量的实验动物。寻找可替代小鼠胚胎成纤维细胞支持干细胞生长增殖的稳定细胞系,对于降低干细胞的培养成本和减少工作量具有重要意义。L-Wnt3a细胞是一个能够稳定向细胞外分泌Wnt3A蛋白的永生细胞系,目前尚不清楚其是否支持小鼠胚胎干细胞的培养。本研究探讨L-Wnt3a作为饲养层细胞对于小鼠(Mus musculus)胚胎干细胞系的建立以及该细胞条件培养液对无饲养层培养小鼠胚胎干细胞的影响。实验结果表明,丝裂霉素C浓度为10μg/mL,作用4 h时,可显著抑制L-Wnt3a细胞的体外生长而不影响细胞的活力。用该细胞制备饲养层,原代分离、培养小鼠胚胎干细胞,成功建立小鼠胚胎干细胞系。利用L-Wnt3a细胞制备条件培养液进行胚胎干细胞的培养,结果显示,L-Wnt3a条件培养液可支持小鼠胚胎干细胞在无饲养层条件下自我增殖,该条件下培养的胚胎干细胞表达碱性磷酸酶、Oct4、Sox2、Nanog、E-cadherin(E-CAD)和SSEA-1多能性因子,并能够在体内、外分化为3个胚层,形成嵌合体后代。L-Wnt3a细胞作为饲养层细胞,能够成功分离获得小鼠胚胎干细胞,可以避免小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞存在的代数限制、制备繁琐等问题;并且LWnt3a条件培养液可以在无饲养层条件下维持小鼠胚胎干细胞的自我更新,能够在一定程度上有效避免饲养层细胞对胚胎干细胞造成的不利影响。 相似文献
2.
研究鼠胚成纤维细胞系STO (SIM-6-thiogunanie-oualiain)诱导为多功能干细胞(induced pluripotent stem cells),(STO-iPSCs).通过磷酸钙法将连接有Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4个转录因子的慢病毒载体FUW-OSKM转染293FT细胞包装病毒,然后用病毒感染STO细胞,以干细胞培养条件培养.挑取诱导15d的克隆并在有饲养层和无饲养层的培养体系中培养.对获取的STO-iPSCs进行生物学特性分析,具有典型胚胎干细胞的形态特征,碱性磷酸酶染色呈阳性;qPCR结果表明,表达很高的原癌基因Nanog和Oct4 mRNAs;免疫细胞化学表明,表达胚胎干细胞特异性标志Nanog和Oct4,并且能够体外诱导分化为神经细胞.实验获得了STO-iPSCs,建立了STO-iPSCs无饲养层培养体系. 相似文献
3.
影响人类胚胎生殖细胞分离克隆的因素 总被引：7，自引：0，他引：7
探讨胚龄培养液、细胞因子、饲养层细胞等因素对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响。以4～13周龄流产胎儿生殖嵴或性腺为材料，小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、人胎儿成纤维细胞(hEF)、STO细胞和牛胎儿成纤维细胞(bEF)作饲养层，高糖DMEM(Dulbecco's minimum Eagle’s medium)为基础培养液，添加10^-4mol／L 2Me(2-巯基乙醇)、胎牛血清(FBS)或新生牛血清(NBS)、白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞冈子(SCF)等为培养液，探讨影响人类胚胎生殖细胞分离克隆的因素。结果表明7～12周流产儿适于人类胚胎生殖细胞的分离克隆；人类胚胎生殖细胞体外培养以添加15％FBS为宜：添加4ng／mL LIF 4ng／mL bFGF 20ng／mL SCF能明显改善人类胚胎生殖细胞的分离克隆；MEF、STO、bEF和hEF可提高人原始生殖细胞(PGCs)的贴壁率，能促进PGCs源的人类胚胎干细胞(ES)的分离效率；以MEF作为饲养层效果较好。 相似文献
4.
采用类胚体法(EB)的EB分化4-／4 程序和单层分化法研究不同的实验方法对胚胎干细胞神经分化的影响。用4-／4 分化程序进行胚胎干细胞的神经分化时，饲养层细胞的存在对类胚体的形成无影响，在神经分化的13d，仍可观察到46C细胞的Sox1-GFP绿色荧光，此时的免疫染色结果显示，分化细胞中除了有Nestin阳性的神经干细胞及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性的神经胶质细胞外，以β-tubulin Ⅱ阳性神经元细胞最为多见，这些神经元呈现出多种形态；用单层分化法进行胚胎干细胞(ES)细胞的神经分化至13d时，分化形成的神经细胞种类与类胚体法相同，但神经元的细长纤维形成了复杂的网状结构，提示两种分化方法获得的神经元处于不同发育阶段。研究结果表明，两种分化方法均能为ES细胞提供从神经分化的起始到继续分化所需的环境，EB分化法适合于大量地获取分化的细胞，而单层分化法可直观地研究分化过程的细胞变化。 相似文献
5.
利用稳定干扰载体pSuper-cNanog和pSuper-cPouV转染鸡(Gallus gallus)胚胎干细胞(chicken embryonic stem cells,cESCs),观察多能性相关基因cNanog和cPouV下调后cESCs的增殖特性和多能性标记的改变。Real-time PCR检测分析结果显示,cNanog和cPouV两基因的表达量从48 h开始出现显著下降趋势,并随着转染筛选时间的延长而呈现持续显著下降趋势,96 h可达65%以上(P0.05)。下调cNanog和cPouV基因的表达后,cESCs呈现分化形态,细胞增殖速度减慢,隆起逐渐不明显,边缘不整齐。待筛选后培养至96 h时,干扰cNanog基因的细胞多能性标记碱性磷酸酶(alkline phosphatase,AKP)和阶段特异性胚胎抗原1(stage-specific embryonic antigen-1,SSEA-1)均不表达,而干扰cPouV基因的细胞中则仍有部分表达。将下调cPouV基因的cESCs再次用pSuper-cNanog转染,培养48 h多能性标记AKP和SSEA-1均不表达。结果说明,cNanog和cPouV基因在维持鸡胚胎干细胞多能性和自我更新中起重要作用,且cNanog基因占主导地位。本研究为研究家禽胚胎发育的分子机制以及家禽胚胎干细胞体外培养时自我更新和多能性维持的分子机制提供理论依据。 相似文献
6.
比较胚胎的不同处理方法,不同饲养层对兔胚胎内细胞团(ICM)贴壁和增殖的影响。结果显示:消化掉外层粘蛋白和部分透明带的胚胎96 h贴壁率(85.29%,29/34)较高,内细胞团生长良好;超排组胚胎的贴壁率和内细胞团(ICM)原代克隆率与自然发情组差异不显著(85.71%vs 88.06%,21.43%vs19.40%,P>0.05);与对照组(12.5%,3.13%)相比,在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层(M EF)和兔胚胎成纤维细胞饲养层(REF)上培养获得的呈聚集状生长ICM及ICM原代克隆率较高(P<0.01),M EF组和REF组差异不显著(54.1%,22.95%vs 51.92%,17.31%,P>0.05),但REF饲养层培养效果不稳定。研究结果表明,兔早期胚胎消化掉外层粘蛋白和部分透明带有利于胚胎内细胞团贴壁和增殖;超排处理不影响从兔胚中分离胚胎干细胞(ES);小鼠胚胎成纤维细胞饲养层能有效支持兔胚内细胞团的贴壁和增殖。 相似文献
7.
探讨兔(Lepus brachyurus)胚胎的不同处理方法对兔早期胚胎体外发育能力的影响,筛选出适合兔类胚胎干细胞(embryonic stem,ES)分离培养的兔胚胎的较佳处理方法。将兔胚胎用3种不同的方式进行处理,观察兔类ES细胞贴壁、克隆、生长情况,并对所得的兔类ES细胞进行碱性磷酸酶活性鉴定、干细胞转录因子的RT-PCR检测和体外分化能力的鉴定。结果显示,挑破透明带法和胚胎分割法较对照组得到的胚胎更容易贴壁和增殖,差异显著(P0.05),虽然离散胚组的胚胎贴壁率(88.9%)显著高于挑破透明带组(53.8%)(P0.05),但挑破透明带组的ICM形成率(48.8%)高于离散胚组(40.0%)(P0.05),挑破透明带组F1、F2代兔类ES细胞的克隆率分别为35.7%和33.9%,均显著高于其他两组(P0.05),最高传至30代。获得的兔类ES细胞经碱性磷酸酶染色检测呈阳性。提取兔类ES细胞集落的RNA,经RT-PCR检测,得到扩增多能基因GAPDH、Nanog和Sox2与预期大小一致的目的片段。体外分化形成具有3个胚层构成的类胚体(embryoidbodies,EBs)。结果表明,挑破透明带有利于提高从兔胚胎中分离胚胎干细胞的效率,能更好的支持兔类ES细胞的培养与增殖。 相似文献
8.
猪胚胎干细胞培养、分离和传代 总被引：4，自引：0，他引：4
摘要:利用五指山小型猪近交系不同发育阶段的早期胚胎为材料，探索猪胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)培养、分离、传代的影响因素，以选择猪胚胎干细胞建系的适宜条件。收集五指山猪第5～10 d胚胎(配种当天记为0 d)，以 STO细胞[STO细胞是来自SIM小鼠(S)胚胎对硫代鸟嘌呤(thioguanine,T)和乌本苷(ouabain,O)有抗性的成纤维细胞系]为饲养层，分别采用两种培养液: 杜氏培养液(Dulbecco's modified eagle medium ，DMEM) + 10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）+ 10 %新生牛血清（newborn bovine serum，NBS）+1 000 IU/mL白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）+ 30 ng/mL干细胞生长因子（stem cell growth factor , SCF）+20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ，bFGF)或DMEM + 10% NBS + 10% FBS + 1 000 IU/mL LIF + 30 ng/mL SCF。比较发现，培养液中是否加入bFGF对胚胎干细胞的培养无显著影响；实验共收集胚胎124枚，其中D5～6胚胎18枚，胚胎贴壁率为68.8% ，内细胞团出现率为6.3% ，未能传代；收集D7孵化囊胚27枚，贴壁率为100% ，内细胞团出现率为38.9% ，传代1次失败；D9胚胎18枚，贴壁率为100%，传代后ES细胞生长较缓慢；收集D10胚胎52枚，胚胎贴壁率为100%，传代率为100%，传代后可出现ES细胞克隆点；实验过程中比较了胚径对干细胞培养的影响，发现胚径越大，培养效果越好，胚径大于100μm,分离ICM后出现干细胞集落成功率达100%，并得到了AP染色呈阳性的传4代的ES细胞集落。 相似文献
9.
以昆明系小鼠(Mus musculus Km)胚胎为材料,以丝裂霉素(10 μg/mL)处理的MEF为饲养层,研究了在胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)培养液中分别添加血清替代物(knockout serum replacement,KSR)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和FBS PD98059(50 μgol/L)对昆明系小鼠胚胎贴壁、内细胞团(inner cell mass,ICM)集落形成及ESCs分离培养的影响.结果表明,在ESCs培养液中添加KSR,胚胎贴壁率显著低于添加FBS(P<0.05),ICM集落形成率和1代ESCs集落出现率差异不显著(P>0.05),2～5代ESCs集落出现率显著高于添加FBS(P<0.05),2株ESCs传到7代;在ESCs培养液中添加FBS PD98059,胚胎贴壁率、ICM集落形成率和1～5代ESCs集落出现率均显著低于添加KSR或FBS(P<0.05);用0.5 g/L胰酶 0.2 g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割,1～5代ESCs集落出现率显著高于用2.5 g/L胰酶 0.2 g/LEDTA(P<0.05).实验结果表明,在ESCs培养液中添加KSR,较添加FBS或FBS PD98059更适合用于分离培养昆明系mESCs,用0.5 g/L胰酶 0.2 g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割优于用2.5 g/L胰酶 0.2 g/L EDTA. 相似文献
11.
原始生殖细胞的发生、发育与EG细胞 总被引：2，自引：0，他引：2
对原始生殖细胞（PGCs）的起源和发生，PGCs发生和发育的相关基因，原始生殖细胞与性别分化，PGCs的分离培养和EG细胞等作一简述。 相似文献
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从原始生殖细胞分离克隆牛胚胎干细胞的研究 总被引：8，自引：0，他引：8
从５～１３周龄的牛胎儿生殖嵴及其周围组织采用与其儿成纤维细胞共培养的方式分离得到大量原始生殖细胞（ＰＧＣｓ）集落。这些集落的细胞经多次克隆传代具有胚胎干（ＥＳ）细胞的诸多特征,如有连续传代的能力（有两个胎儿分别传至６代和８代）,细胞集落有典型鸟巢状结构。ＡＫＰ染色阳性,体外分化实验具有形成类胚体力能力。上述表明该细胞具有多能性,类似ＥＳ细胞。 相似文献
13.
原始生殖细胞的人类ES细胞的分离克隆 总被引：6，自引：0，他引：6
本研究收集47例4-13周龄人流产胎儿分离PGCs，采用与其生殖嵴/腺或类似物胎儿成纤维细胞共培养的方式，获得了具小鼠ES细胞或EG细胞特征的人类ES细胞，该类细胞在体外可自发分化为类胚体，成纤维细胞样细胞，神经胶质细胞样细胞及心脏跳动样细胞团等，同样方法自4例大于17周龄胎儿未观察到人类ES细胞，研究表明，采用共培养法可以从4-13周龄流产儿的PGCs分离克隆到人类ES细胞，最适宜胎龄为7-10周龄。 相似文献
14.
肌肉卫星细胞是源自中胚层的肌源干细胞,具有增殖分化融合成肌管并形成肌细胞的能力.在体内条件下,肌肉卫星细胞不可能跨胚层分化为内胚层来源的胰腺细胞.本研究从牛(Bos taurus)胎儿肌肉中分离培养得到肌肉卫星细胞,并在体外条件下将其诱导成胰岛素分泌细胞.在诱导过程中,分析了与胰腺发育相关的胰十二指肠同源基因盒1基因(pancreatic and duodenal homeobox 1,PDX1)、神经原素3基因(neurogenin 3,NGN3)、淀粉酶基因(Amylase)和胰岛素基因(Insulin,INS)的动态表达情况.结果表明,PDX1作为决定胰腺分化发育和胰岛功能的主要调节基因,在诱导分化的第2天能够检测到其mRNA的表达,在第3天表达量达到了最大,第4天以后维持在较低水平.NGN3是内分泌细胞形成非常重要的转录因子,是能够将胰岛素分泌到胞外的关键基因,其mRNA在分化诱导的第3天开始表达,第4天达到最高水平,之后逐渐下降.Amylase是胰腺发育中细胞外分泌相关的基因,Amylase mRNA在第6天才开始表达,8d后达到最高.INS mRNA表达量在11～12 d最高,酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)发现,诱导形成的胰腺细胞能够正常分泌胰岛素,培养液中胰岛素的浓度在诱导的11～12 d达到最高值.向培养液中添加葡萄糖后,可使细胞的胰岛素分泌量显著提高,说明诱导得到的细胞类似于成体胰岛的功能,其胰岛素分泌受外界葡萄糖浓度的调节.上述结果表明,肌肉卫星细胞可以被诱导转分化为胰岛素分泌细胞,并对培养环境中的葡萄糖刺激做出应答反应.本研究结果为进一步的研究和临床应用提供基础资料. 相似文献
15.
黄甜 《农业生物技术学报》2011,(3)
诱导多能干细胞(iPSCs)是由体细胞经过特定的因子诱导重编程而来,它作为细胞更新的来源在再生医学上有着很大的应用前景。人们普遍认为产生iPSCs的个体不会排斥这种自体同源的细胞,但是它们的免疫原性没有被真正的检测过。美国加州 相似文献
16.
为提高昆明小鼠胚胎生殖细胞(embryonic germ cells, EG cells)建系效率，以怀孕8.5～12.5 d小鼠胎儿为材料，比较了胎儿后1/3部位的组织共培养、生殖嵴共培养、差速贴壁和穿刺生殖嵴4种分离胚胎原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)的方法以及不同传代方式对EG细胞克隆的影响。结果表明：生殖嵴共培养和差速贴壁方式获得了较好分离EG细胞的效果，与其它两组比较差异显著；手工传代方式与连同成纤维细胞一起消化的传代方式相比获得了较高传代比率。对所分离EG细胞经形态观察、AKP染色和体外分化能力检测，证实其符合小鼠EG细胞的集落状生长、细胞未分化特性及细胞多能性等特征。 相似文献
17.
J. J. Oertli 《植物养料与土壤学杂志》1986,149(1):60-67
Non-osmotic moisture stress can be simulated by applying to a plant tissue a solute that cannot penetrate the cell wall. The external reduction in water potential caused by such a non-penetrating solute is compensated for by a reduction in pressure within the cell. The pressure is ambient throughout a cell that has been plasmolysed by a penetrating osmoticum. A supplementary non-penetrating osmoticum must also be compensated for by lowering the internal pressure, i.e. a negative turgor pressure must develop. Onion skin cells can withstand a resulting mechanical stress of up to about 10KPa (1/10 Bar) before collapsing. 相似文献
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为了阐明支持细胞增殖和分化能力对精子生成的影响,本实验以7、21和35d仔猪为材料,利用细胞直接计数、免疫组织化学、流式细胞术和免疫印迹分析了仔猪睾丸支持细胞、生精细胞数量和增殖能力变化以及支持细胞的成熟分化状况。结果:(1)从7～21d,曲细精管中支持细胞与其它细胞之间的界线更加明显;从7～35d,每克睾丸中间质细胞和支持细胞的数量在21d时达到高峰(P<0.05),而生精细胞的数量则一直增加(P<0.05),但并没有在曲细精管中发现圆形精子;(2)从7～35d,支持细胞和间质细胞都能表达GATA-4,支持细胞中GATA-4的累积光密度(IOD)在21d时最高(P<0.05),而间质细胞中的IOD在21d和35d之间没有明显差异(P>0.05);(3)从7～35d,整个睾丸细胞都有增殖能力,睾丸细胞的细胞增殖指数(PI)和S期细胞指数(SPF)在21d时最高(P<0.05);三种细胞在这一时期都能表达PCNA,三种细胞PCNA的IOD值和睾丸中PCNA的表达水平在21d时最高(P<0.05);(4)从7～35d,Connexin 43(Cx43)主要表达于支持细胞的细胞质,支持细胞和间质细胞中的IODs在2... 相似文献