共查询到20条相似文献，搜索用时 15 毫秒
1.
双链DNA(dsDNA)定量分析是植物分子生物学研究的基础,对基因型分析尤为重要。本研究以λ噬菌体dsDNA为标准样品,建立了荧光定量标准曲线,探讨荧光核酸定量通量性及其与紫外法定量的差异,并分析荧光染料在基因分型中的应用。结果表明,荧光染料能够对dsDNA进行高效微量定量分析(1.1ngmL-1),但因鉴定核酸的浓度较低,对小麦籽粒和叶片全基因组DNA定量时稀释倍数较大,易增大浓度误差。降低反应体系量导致标准曲线决定系数降低,影响测量准确性。精确定量dsDNA浓度时,总反应体系应大于200mL;对PCR产物进行基因分型时,总反应体系应不低于40mL。相同DNA模板浓度下,FLUOstar平台可以对抗秆锈病基因显性标记csSr32#1(Sr32)和IB-267(Sr50)的PCR产物进行基因型分型,判断准确率为100%。对特异性强且等位基因片段差异大(≥100bp)的共显性标记,如抗叶锈病基因标记We173(Yr26)等,用荧光染料同样可以进行基因分型。与琼脂糖凝胶电泳相比,荧光染料鉴定等位基因价格略高,但方法简单、准确快速、重现性好,可用于分子育种中世代材料快速筛选。 相似文献
2.
利用组织研磨仪快速处理水稻种子样品,采用高通量的磁珠纯化系统提取样本DNA,提取的核酸通过紫外吸收检测其纯度,应用普通PCR检测方法和实时荧光PCR方法对水稻内源基因SPS、靶基因ATAF1进行检测。结果表明,普通PCR方法和实时荧光PCR方法均表现快速、准确、特异性高的特点。 相似文献
3.
大白菜基因组DNA快速提取方法的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
《华北农学报》2017,(6)
快速高效的DNA提取是作物大规模分子育种的关键一步。旨为构建一种快速提取大白菜基因组DNA的方法,以大白菜叶片为试验材料,比较了CTAB法、二步CTAB法以及4种碱裂解法提取DNA的质量,分析了不同方法提取的DNA为模板的PCR扩增效果,还对不同方法提取的基因组DNA的保存时间和保存条件进行了比较,选择最优的方法在抗根肿病基因分子标记辅助选择中进行了应用。结果表明,CTAB法和3种碱裂解法提取的基因组DNA作为模板的PCR扩增产物,都可以通过8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到清晰的条带。其中碱裂解法Ⅲ,不仅提取质量好,而且提取过程简单、快速,能够满足大白菜高通量DNA提取的需要,提取的DNA在4℃和-20℃的条件下保存,将保存至30 d的基因组DNA作为模板进行PCR扩增,产物仍然可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到清晰的条带,说明这种方法保存时间较长,经验证,该方法在抗根肿病基因分子标记辅助选择中的应用效果也较好。碱裂解法Ⅲ显著提高了大白菜分子标记辅助筛选的效率,可广泛应用于大白菜分子标记辅助选择育种。 相似文献
4.
5.
《种子》2018,(11)
为了满足分子标记辅助育种中基因型鉴定、基因克隆、测序的需要,本研究借用棉签等具吸附功能的材料代替移液器,依次直接在2种DNA提取液中操作,建立了一种简单、快速、环保的水稻叶片DNA提取方法。结果表明,提取溶液通过PCR扩增,满足基因扩增对模板的要求;同时,对其进行了灵敏度测试,稀释107倍仍然能够扩增出目标片段;最后通过PCR、克隆载体连接等分子生物学手段,验证此方法也满足测序的需要。本方法能够在90s内完成植物叶片DNA的提取,解决了目前植物基因组DNA提取方法需要离心机等昂贵特殊设备、提取步骤繁锁、提取过程中刺激味大、提取时间长等问题,有利于大规模开展分子标记辅助育种中材料基因型的鉴定,具有简单、快速、廉价、环保等优点。 相似文献
6.
7.
分子标记辅助选择需要大批量的DNA样品,快速提取DNA的方法是提高选择效率的关键。研究比较多种植物DNA的提取方法,通过优化改进,建立了适于棉花叶片基因组微量快速提取的新方法。该方法增加缓冲液预处理及在TPS缓冲液中添加PVP40,采用PCR板批量取样、微型手电钻磨样,省去了蛋白抽提、DNA沉淀、洗涤、风干、溶解等步骤,免去氯仿和异戊醇的使用。本方法具有低成本、快速、高通量、操作简单等特点,而且能确保提取的棉花DNA的浓度和纯度达到要求,满足大批量样本SSR分子标记辅助育种工作的需要。 相似文献
8.
9.
高通量的PCR模板植物基因组DNA制备方法 总被引：3，自引：1，他引：2
制备大量生物样品的模板DNA用于PCR检测是费时费人工的工作。本文介绍一种高通量的植物基因组DNA (gDNA)快速制备及其用于PCR基因型检测的操作方法。将一小段单子叶植物苗叶片(长度约30 mm或40 mm,与96方孔板的孔深大致相同) 或一小块(约2~4 mg)双子叶植物叶片放入96方孔板的各孔中、放入一粒钨合金珠和150 µL制备缓冲液,盖好硅橡胶盖,在涡旋器振动3~5 min破碎组织。用96针复制器(或多通道移液器)转移每样品约0.5~1.0 µL此粗制gDNA溶液(含有2~3 ng gDNA µL-1)到96孔PCR板的反应液中,适合用各种类型的PCR标记(如简单序列重复SSR,插入缺失InDel等)进行基因型检测,或较大的DNA片段(>1 kb)的扩增,可以得到良好的效果。本方法的关键是控制合适的破碎叶片量与制备溶液量比例(约2~5 mg, 但不超过10 mg 150 µL-1溶液),以及不要加入过多量的gDNA (不超过PCR反应液量的1/10),以免带入过量的杂质抑制PCR。因此,这种从种植材料,制备gDNA, 转移样品gDNA,到PCR都是96格式化操作的高通量、低成本方法适合于大量植物样品的规模化的基因型检测。 相似文献
10.
一种玉米叶片基因组DNA快速提取新方法的初步研究 总被引：8，自引：0，他引：8
在玉米分子标记辅助育种工作中,需要对大量群体的个体样本进行分子标记分析,其中DNA的高效快速提取是关键的技术环节。以异硫氰酸胍为主要提取试剂,结合使用组织研磨器(Qiagen Tissuelyser),建立了一种玉米叶片基因组DNA的快速提取新方法。利用此方法提取玉米叶片基因组DNA,具有使用药品少、操作步骤简单、快速、成本低、DNA质量稳定等优点,通常情况下每人每个工作日可以提取300个DNA样品。此DNA提取方法可有效地用于玉米分子标记分析。 相似文献
11.
DREB转录因子在植物逆境胁迫响应中起非常重要的作用, 对植物的生长发育起重要的调控作用。传统的DNA酶I足迹法应用同位素标记DNA, 采用序列胶分离DNase I酶切片段, 操作较复杂, 分辨率较低, 不适用于高通量的样品检测。为阐明植物体内DREB转录因子的调控机制, 本研究利用改进的DNA酶I足迹法(DNase I Foot-printing)结合凝胶阻滞法(electrophoretic mobility shift assay, EMSA), 选用荧光色素代替同位素标记, 毛细管电泳技术代替序列胶检测DNase I酶切片段, 判定GmMYB1蛋白与GmDREB3启动子DNA结合的区域。采用限制性内切酶酶切GmDREB3启动子DNA验证以上结果。同时, 在判定的GmMYB1结合区域的基础上, 选择可能的DNA结合元件与GmMYB1进行EMSA试验, 证明GmMYB1可以与相应元件结合。该方法比传统的DNA酶I足迹法快速、简便、准确并可靠, 作为一种高通量的鉴定方法可用于大规模鉴定蛋白质的DNA结合位点。 相似文献
12.
小麦基因组的一种简易提取方法 总被引：2，自引：1，他引：1
摘要：【研究目的】在综合分析多种提取小麦DNA方法的基础上,改良发展了一种快速简便高效的小麦基因组DNA提取方法。【方法】以春小麦Thatcher和以Thatcher为背景的近等基因系TcLr19,TcLr20, TcLr28为材料,改进后的方法提取的基因组DNA用抗叶锈基因Lr20的STS标记、Lr19和Lr28的SCAR标记、Lr28的SSR 标记进行PCR扩增,【结果】各分子标记都扩增出条带清晰正确的目的片段【结论】这表明该方法能够获得适用于STS、SCAR、SSR标记PCR扩增的高质量的DNA,而且该DNA简易提取方法加快了DNA提取速度、降低了污染源和成本,为大批量提取DNA提供了技术支撑。 相似文献
13.
14.
一种快速提取小麦基因组DNA的改良CTAB方法 总被引：6，自引：2，他引：4
旨在寻求一种微量、快速提取小麦DNA的方法。以小麦幼叶为材料,用改良CTAB法、改良SDS法、沸水浴法提取小麦叶片总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳法、紫外吸收法和PCR检测DNA完整性和纯度。改良CTAB法提取小麦基因组DNA质量和纯度高、无降解,每人每天可以轻松提取200个DNA样品,对转基因植株的PCR检测显示扩增目标条带清晰一致,无假阳性,试验结果理想。改良SDS法所提DNA纯度和浓度虽略不如改良CTAB法,但仍然符合实验要求。沸水浴法提取量少且杂质多,PCR无有效扩增,结果不理想。改良CTAB法提供了一种简便、快速微量小麦DNA提取方法,适用于PCR和其他分子生物学研究。 相似文献
15.
本研究创建一种简单快捷、成本低廉、灵敏准确及可靠性强的高通量鉴定转基因玉米MON89034转化体的快速检测方法。采用多重实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)对转基因玉米MON89034品系进行检测,并针对转基因玉米MON89034靶标基因设计高效稳定的引物和探针,使用zSSIIb基因作为内源基因,避免检测出现假阴性,将反应体系及条件优化后,用实时荧光定量PCR仪进行扩增,初步建立转基因玉米MON89034双重实时荧光PCR检测方法,通过对该方法进行特异性和大样本可靠性测试验证,继而创建出一种高通量鉴定转基因玉米MON89034转化体的检测方法。通过建立的双重荧光定量PCR方法对转基因玉米、非转基因玉米和转基因大豆的DNA混合模板检测得出的结果表明,多种作物DNA混合模板可在单根PCR反应管内实现对zSSIIb基因和MON89034的同时检测,并在2 h内完成检测得到准确结果。目前,建立的该双重实时荧光PCR方法可用于多个转基因作物样品间快速筛查,检测快速,结果准确,可满足大多数检测机构日常检测的需求。 相似文献
16.
《分子植物育种》2015,(7)
Piz-t是一个具有广谱稻瘟病抗性的基因,对于选育稻瘟病抗性品种具有重要的应用价值,但其所在位点多个不同的等位基因限制了对它的筛选及利用。本研究通过将Piz-t不同等位基因及其上下游测序,比对鉴定到一个Piz-t特异性SNP位点(Piz-t为A,其余均为G)。在两对交叉引物PCR(PCR with confronting two-pair primers,PCR-CTPP)方法的基础上加以改进开发了一套鉴定该SNP的标记,利用该标记及待检测水稻品种基因组DNA进行PCR扩增,通过不同PCR产物条带大小将Piz-t与其它等位基因区分开。该方法简便快速、成本低廉,可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Piz-t基因型鉴定。 相似文献
17.
18.
为了建立一种准确、快速检测三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR方法,基于尖孢镰刀菌脂肪酸ω-羟化酶基因设计了实时荧光定量PCR的特异性引物对Fo-QF和Fo-QR,制备了该基因的重组质粒标准品,建立了尖孢镰刀菌的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。从三七种植区采集到14个具有根腐病、黑斑病典型症状的三七病株及三七种植土壤样品,并提取了这些样品的总DNA,运用本研究建立的荧光定量PCR方法进行了检测。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法特异性强,脂肪酸ω-羟化酶基因只以尖孢镰刀菌DNA为模板扩增出特异的PCR产物。此外,该方法灵敏度高,检测模板浓度可低至0. 35 pg/μL。构建的荧光定量PCR标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,扩增效率好。利用该定量检测体系,能从几种不同的三七病株中快速检测出携带尖孢镰刀菌的根腐病病株,从而达到准确诊断的目的。本方法不仅能明确三七种植土壤以及三七病株中尖孢镰刀菌数量的动态变化,并且可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及带病三七种子、种苗的快速分子检测提供技术支持。 相似文献
19.
《分子植物育种》2019,(4)
为了提高抗病性分子标记检测的效率,为番茄病害检测及多抗品种选育提供技术依据,本研究通过改良CTAB法、96孔深孔板快速提取番茄微量叶片DNA;利用抗根结线虫病Mi标记,在L16(45)正交设计试验基础上,采用直观量化分析和方差分析两种方法,对番茄实用化PCR分子标记PCR反应的5个因素(引物, Mg2+, dNTPs,模板DNA和Taq酶)进行优化;随后分别筛选黄化曲叶病毒病、烟草花叶病毒病、根结线虫病、枯萎病、叶霉病和颈腐根腐病6种病害的8个实用化PCR分子标记PCR程序的退火温度;并对循环次数进行筛选;最后利用优化后的PCR体系与程序对供试的1 442份番茄材料(包括番茄种质资源,群体材料,组合及品种)进行抗病性鉴定。结果表明番茄实用化PCR分子标记的PCR最佳反应体系(20μL)为引物0.5μmol/L、Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 0.3 mmol/L、DNA 480 ng DNA、聚合酶1.0 U Taq;PCR程序中8个分子标记共同最适退火温度为56℃,最佳循环次数为33次;筛选出585份多抗(含2种以上的抗病基因)番茄材料,可作为中间材料或亲本材料进行多抗品种选育。该实用化PCR分子标记的PCR体系的建立为番茄利用抗病基因分子标记检测与筛选多抗种质资源、品种或群体材料提供了标准化的程序。 相似文献
20.
【研究目的】为了寻找一种适用于病毒诱导的基因沉默番茄叶片PCR检测的快速、简单、成本低的DNA提取方法。【方法】笔者根据PCR反应的要求,用改良的CTAB法,实现了微量番茄叶片基因组DNA的快速提取。【结果】提取基因组DNA所用的组织量虽少,所得的DNA经过电泳检测虽有降解,但足以用于PCR检测,以其作模板扩增中国番茄黄化曲叶病毒诱导的硫黄素酶(Su)基因沉默植株中病毒组分中的DNAmβ和1.7A,片段大小分别为500bp、1300bp。测序结果证明是相应基因的部分片段。【结论】该方法的材料不需要使用液氮,可以单人大批量提取,并在基因沉默的番茄植株中能稳定而准确的规模化PCR检测。 相似文献