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提高农杆菌介导法将PinII抗虫基因导入滇型水稻的转化效率 总被引：4，自引：0，他引：4
本论文对滇型水稻品种玉优一号、HT-7的愈伤组织诱导、基因转化及植株再生进行了研究。通过实验，将质粒pCAMBI1300上带有的PinⅡ抗虫基因导入水稻愈伤组织细胞中，获得了一批Hyg抗性植株。185株抗性苗经过PCR检测和叶片对潮霉素的抗性试验，证明其中有59株为转基因阳性植株。结果显示，受体、农杆菌状态以及共培养方式等是影响基因转化效率的关键因素；以叶片对潮霉素的抗性作为转基因植株的快速筛选是可行的，大大提高了检测效率。 相似文献
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microRNA(miRNA)是长度为18~25个碱基的非编码单链RNA,在植物生长发育过程中起着重要的调节作用。水稻是世界上重要的粮食作物之一,近年来调控水稻生长发育的miRNA不断被发掘,但目前关于miR1866的研究还比较少。本研究通过构建miR1866的CRISPR/Cas9表达载体,创制miR1866的突变体,挖掘水稻miR1866的功能。依据CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计了miR1866的突变靶点,通过人工合成的方法得到包含突变靶点的特异序列,经过磷酸化修饰和退火后与载体Sg RNA连接进而与Cas9重组得到miR1866的CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,获得转基因植株,结合测序结果判断转基因植株突变单株的突变基因型。本研究比较了野生型和突变体(KO1866-1-2和KO1866-2-4)在相同培养条件下苗期的根长、株高、茎基粗、鲜重和干重,结果表明:在营养液培养条件下,突变体的株高、根长、茎基粗、鲜重和干重均显著低于野生型。据此推测,miR1866对水稻的生长发育有一定的调节作用。本研究利用CRISPR/Cas9创制水稻miR1866的突变体,对研究miRNA调控途径,完善水稻miRNA调控的分子机制具有重要的意义。 相似文献
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为了创制可免除人工授粉的转基因罗汉果雌性品系,利用植物双元表达载体pBI121-Gus,构建幼果实特异启动子2A11与单性结实相关基因rolB的嵌合基因表达载体pBAR (pBI121-2A11-rolB)。以罗汉果雌株叶盘为材料,以EHA105农杆菌介导遗传转化,经PCR扩增,鉴定出阳性植株,对阳性雌株进行扩繁、生根,最后移栽大田,并观察转基因植株的单性结实性状表现。结果显示,成功构建了单性结实相关基因的pBAR嵌合双元表达载体;转化感受态根癌农杆菌EHA105后,进一步转化雌株叶片,经过对叶片分化苗的检测,得到7株阳性植株,转化率为14.29%。为提高成活率,扩繁7株阳性植株,获得37株转基因单性结实植株株系,其中有8株正常开花,占总数的21.62%,正常开花的植株,未经人工授粉,发育成幼果,表现出单性结实性状。本实验在克隆单性结实相关基因和果实特异启动子的基础上,构建嵌合基因载体,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法,获得了转基因罗汉果单性结实雌株系,为后续研究罗汉果单性结实性的遗传、生理、品种综合改良和深入利用提供了基础。 相似文献
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转cry1C*及cry2A*基因早粳稻Bt蛋白的时空表达和抗螟虫性 总被引：1，自引：0，他引：1
早粳稻空育131为受体, 以根瘤农杆菌介导遗传转化法创制了转ubi启动子调控下的cry1C*及cry2A*基因早粳稻空育131 (cry1C*)和空育131(cry2A*)。为了研究转基因水稻Bt蛋白的时空表达特性及抗螟虫性, 将不同转化事件形成的转基因早粳稻品系种植于田间, 利用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测转基因水稻不同生长发育阶段不同器官的、以及成熟期糙米的Bt蛋白量, 采用室内离体茎秆法接虫鉴定转基因水稻的抗螟虫性。结果显示, 转基因早粳稻不同抗虫基因Bt蛋白量不同, cry1C*基因总是低于cry2A*基因的蛋白质表达量; 不同生长发育时期Bt蛋白量不同, 叶片和茎鞘等器官的Bt蛋白量为分蘖期<抽穗期<灌浆期, 幼穗或糙米等器官的Bt蛋白量为抽穗期幼穗>灌浆期幼穗>成熟期糙米; 不同器官Bt蛋白量不同, 高低次序在分蘖期为叶片、茎鞘, 抽穗期为叶片、幼穗和茎鞘, 灌浆及成熟期为叶片、茎鞘、幼穗和糙米; 同一抗虫基因不同转基因品系间抽穗期叶片、茎鞘和幼穗等器官Bt蛋白量及抗螟虫性、糙米Bt蛋白量等性状存在差异, 抽穗期各器官Bt蛋白量与抗螟虫性及成熟期糙米Bt蛋白量之间相关不显著, 不论Bt蛋白量高或低的品系均表现为高抗螟虫。转基因早粳稻营养器官生长发育前期Bt蛋白量较低、后期较高, 繁殖器官生长发育早期Bt蛋白量较高、晚期较低, 营养器官通常比繁殖器官的Bt蛋白量高。在本研究范围内, 不同基因及不同转化事件培育的转基因水稻Bt蛋白表达量高低不同, 但所有的转基因早粳稻品系均表现高抗螟虫。 相似文献
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人源性胰岛素样生长因子1(hIGF-1)是一类在许多人类疾病治疗中都具有重要作用的细胞因子.本研究成功构建了以水稻种子高效表达的谷蛋白Gti基因5.3kb启动子引导hIGF-1基因(higf-1)的表达载体:pCAMBIA 1301-5.3kbGt1-higf-1-nos.在此基础上,将构建好的表达载体,通过根癌农杆菌介导法转化水稻,获得转基因植株.通过对转基因水稻植株叶片总DNA的PCR检测,初步确定表达载体的T-DNA区段已经成功整合入水稻基因组中.目的基因RT-PCR检测结果显示,higf-1在转基因水稻种子中能够正常转录.开展本试验为利用水稻及其他单子叶植物表达IGF-1研究奠定了基础. 相似文献
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利用农杆菌介导的转化方法研究OsPK1过表达对水稻的影响。将CaMV 35S启动子驱动的OsPK1的全长CDS序列导入到日本晴基因组中。选择3个过表达转基因系作为代表进行鉴定和分析。结果显示,过表达植株在株高、分蘖数、穗长和千粒重四方面接近野生型水稻,结实率略下降,但每穗饱满种子数明显增加。通过定量RT-PCR分析,发现有4个代谢酶在过表达植株嫩叶中表达存在着上调或下调。用GC-MS方法检测糖含量,显示OsPK1过表达株系中葡萄糖、果糖、半乳糖和蔗糖的含量与野生型差异不大。总之,对OsPK1过表达株系的鉴定,有助于更好了解OsPK1的功能,并且每穗饱满种子数明显增加具潜在的应用价值。 相似文献
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《作物杂志》2016,(3)
基于实验室前期野生大豆G07256碱胁迫转录组数据,结合生物信息学方法筛选得到响应碱胁迫的cation/H+逆向转运蛋白基因Gs CHX19,克隆了Gs CHX19基因全长CDS编码序列并将其构建到p CAMBIA330035Su植物超量表达载体中。以肇东紫花苜蓿为受体材料,通过农杆菌介导法将重组的植物表达载体转化其子叶节,用含0.5mg/L草铵膦的筛选培养基进行筛选,获得20株抗性植株。采用PCR方法检测抗性植株中bar基因的表达,获得16株PCR阳性植株。对获得的PCR阳性植株进行RT-PCR及real-time PCR检测,鉴定共获得11株RT-PCR阳性植株,且证明Gs CHX19基因在各转基因植株中均有不同程度的表达。结果表明,Gs CHX19基因成功转化苜蓿,并且得到表达,该转基因植株将为耐盐碱转基因苜蓿新品种的培育提供重要的试验材料。 相似文献
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水稻质膜H+-ATPase基因对拟南芥遗传转化及其抗盐性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
RT-PCR扩增得水稻质膜H -ATPase全长cDNA(PM-H -ATPase),构建了植物表达载体获得质粒pBI121-PM-H -ATPase,农杆菌介导、真空渗入法转化PM-H -ATPase基因入拟南芥,得35株T1代卡那抗性植株.抗性植株PCR分析表明,抗性植株整合了目的基因.Northern杂交分析进一步表明T3代转基因拟南芥表达了目的基因.抗盐(NaHCO3和NaC1)性分析表明:转基因植株的耐盐能力明显高于野生型;盐碱胁迫下转基因植株开花优先于野生型植株. 相似文献
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《华北农学报》2021,36(3)
为研究水稻生长素响应因子OsARF12在水稻生长发育中的作用,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计OsARF12 2个不同外显子突变靶点,化学合成包括突变靶点的特异性序列,并与中间载体sgRNA连接进而与Cas9终载体重组获得OsARF12 2个不同突变靶点的表达载体。选取测序成功的单一克隆,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,获得转基因植株,并结合测序结果分析突变单株的突变类型,T_1突变体KO-ARF12-1有3种纯合突变、2种双等位突变,共5种突变类型;KO-ARF12-2有6种纯合突变、4种双等位突变和1种杂合突变,共11种突变类型。挑选突变类型为缺失1 nt、缺失4 nt、缺失7 nt和缺失2 nt插入1 nt、缺失5 nt的株系作为研究对象,荧光定量PCR鉴定结果表明,OsARF12在突变体中的表达量较野生型极显著下降(P0.01)。在正常大田生长条件下,2种突变体不同突变类型株系与野生型相比,株高显著降低,降幅为13.15%～18.39%;第1,2茎节间长度无显著差异,第3,4茎节间长度显著降低,降幅为21.91%,23.46%。利用CRISPR/Cas9创制的OsARF12突变体,对水稻节间延伸及株高具有一定调节作用,对于完善水稻生长素响应因子的分子调控机制具有重要意义。 相似文献
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苏云金芽胞杆菌抗软腐病aiiA基因转花魔芋研究 总被引：3，自引：0，他引：3
采用农杆菌介导的遗传转化方法,将来自苏云金芽胞杆菌经密码子优化的人工合成酰基高丝氨酸环内酯酶aiiA基因导入花魔芋,以提高魔芋抗软腐病的能力.以花魔芋的茎为外植体,通过与含有植物双元表达载体pU1301的农杆菌EHA105共培养,将aiiA基因导入魔芋基因组.经过潮霉素两次筛选,得到9块独立的抗性愈伤组织,经分化,生根,移入温室盆栽成活的抗性再生苗34株.对不同抗性愈伤来源的T0代再生苗进行PCR检测得到的阳性植株比例为62.7%,斑点杂交进一步确认外源aiiA基因已成功地整合到魔芋基因组中.Western杂交显示,aiiA基因在魔芋植株中能正常表达,其最高表达量占魔芋叶片总可溶蛋白的0.02%～0.06%.酰基高丝氨酸环内酯酶活性检测表明转基因魔芋叶片的蛋白可以降解酰基高丝氨酸环内酯信号分子. 相似文献
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水稻常用的遗传转化技术及应用现状 总被引：1，自引：1，他引：0
1988年，三个独立的研究小组 率先报道获得了转基因水稻植株（Toriyama等,1988，Zhang,等,1988，Zhang等, 1988）。 十多年来，基因转移技术体系的建立一直是转基因水稻研究的重点。 在遗传转化技术应用方面，前期以采用原生质体为材料的PEG法和电激法为主，但原生质体 培养及再生对基因型依赖很大，转基因株育性较低；中期基因枪法得到了很大发展，迄今还 是单子叶植物首选的基因转化方法之一；而自90年代中期以来，农杆菌介导法在水稻基因转 移中日趋成熟，Hiei等（1994）创造的高效转化技术，首次证实了利用农杆菌转化水稻的 可行性，之后该法得到了广泛的应用。目前，水稻转化中应用比较普遍的方法有基因枪介导 法和农杆菌介导法。 相似文献
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水稻T-DNA插入群体的建立及突变体筛选 总被引：1，自引：0，他引：1
为了给水稻功能基因组学研究提供材料,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化法转化水稻品种日本晴(Oryza sative L.ssp.japonica cv.Nipponbare),共建立了1833株独立的水稻T-DNA插入群体.T0通过PCR、GUS染色和southem blot分析证明了再生植株为转基因植株.随机选取种植T1种子20粒,进行突变体筛选.通过对各个时期表型的观察和接种试验,共发现突变体208个,突变率为11.3%,表型涉及株高、叶片、穗型、生育期、颖花、颖壳着色、抗病性等.这些突变体不仅创造了具有优良农艺性状的水稻育种材料,为水稻育种提供新的基因资源,而且为水稻功能基因组研究打下坚实的基础. 相似文献
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农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因sb401导入水稻 总被引：6，自引：0，他引：6
培育高赖氨酸的水稻品种是提高稻米营养品质的重要途径。本研究利用农杆菌介导法将水稻胚乳特异表达启动子PGlu驱动的马铃薯花粉特异水溶性蛋白基因sb401导入粳稻品种日本晴和籼稻恢复系501R的幼胚愈伤组织中,以期提高水稻胚乳中赖氨酸的含量。经PCR检测,从70株T0再生植株中筛选出18株转基因植株(日本晴13株,501R5株)。对转基因植株的Southern blotting分析表明,sb401基因已经转入并整合进了水稻基因组中。测定10株T0代转基因植株成熟种子的总蛋白含量和赖氨酸含量,结果表明,有8株的总蛋白含量,5株的赖氨酸含量皆提高了20％以上;其中,8号样品(日本晴转基因植株)的种子总蛋白含量和赖氨酸含量分别为10．5％和0．383％,与对照相比分别提高了32．74％和35．34％,表明sb401基因在大部分转基因植株中的翻译水平上得到了比较有效的表达。 相似文献
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CPD (constitutive photomorphogenesis and dwarf)基因编码C-3氧化酶, 为油菜素内酯(brassinosteroid, BR)生物合成途径中的限速酶, 在植物响应逆境胁迫过程中具重要调控作用。本研究利用人工microRNA (artificial microRNA, amiRNA)技术, 构建马铃薯CPD基因(StCPD)的干扰表达载体pCPB121-amiRcpd, 通过根癌农杆菌介导法将其转入马铃薯栽培品种“紫花白”, 获得转基因植株(Ci1~Ci5), 其中Ci1和Ci3的StCPD基因干扰程度分别为78%和90%。基因组织表达特异性分析表明, StCPD在马铃薯试管苗叶片中表达量最高, 是茎和根中表达量的3.05倍和1.65倍。转基因植株株高、茎粗、根长、鲜重及薯的大小和鲜重等指标均较非转基因(NT)植株显著下降, 表明StCPD基因干扰表达后, 植株的长势明显受到抑制。模拟干旱胁迫处理下, 转基因植株叶片中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量显著高于NT植株, 而脯氨酸含量显著低于NT植株。转基因和NT马铃薯中, StCPD基因的表达量、MDA和脯氨酸含量均显著高于对照; 且随着胁迫处理时间延长, 基因表达量呈持续增强趋势, MDA和脯氨酸含量随之增加。结果表明, StCPD基因干扰表达能明显降低马铃薯对干旱胁迫的抵抗能力, 为进一步研究BR对马铃薯生长发育和对干旱胁迫的响应奠定了基础。 相似文献