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1.
《江苏农业科学》2016,(3)
苔藓植物能否合成木质素目前还存在一定的争议。肉桂醇脱氢酶(CAD)催化木质素单体合成的最后一步反应,Real-TimePCR表达分析表明,小立碗藓CAD1基因在接种灰霉菌后的第2天表达量迅速上升。本试验利用PCR技术,以小立碗藓基因组DNA为模板,使用Primer5-Cracked设计的引物,扩增出小立碗藓CAD1基因的上、下游同源臂基因片段。酶切CAD1上游同源臂和pTN182原始质粒,经连接酶连接、转化至感受态大肠杆菌,筛选出阳性株。采用裂解液裂解、质粒DNA提取、质粒PCR以及酶切进行验证,得到CAD11-pTN182。采用同样的方法把下游片段转入CAD11-pTN182,即得CAD11-pTN182-CAD12,最后进行测序分析。结果表明,已成功构建CAD11-pTN182-CAD12敲除载体,并将该重组质粒转入目的菌株大肠杆菌中保存备用,可为后续进行小立碗藓CAD1基因敲除,验证小立碗藓CAD1基因功能,进一步了解模式植物小立碗藓防卫反应机理研究奠定良好基础。 相似文献
2.
木质素是植物抵御外界环境的重要成分,肉桂醇脱氢酶（cinnamic alcohol dehydrogenase,CAD）是木质素合成途径中的关键酶和限速酶之一。前期数据表明,在灰霉菌侵染下,PpCAD4基因上调表达,但PpCAD4功能尚未明确。本次研究利用同源重组原理构建PpCAD4.1-PTN182-PpCAD4.2敲除载体,从而破坏PpCAD4的alcohol dehydrogenase GroES-like domain（ADH_N）和zinc-binding dehydrogenase（ADH_zinc_N）结构域。利用PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选并鉴定得到敲除PpCAD4突变体植株。qRT-PCR表明,敲除型植株中PpCAD4的表达量相对野生型减少了84%。通过对配子体的形态观察发现,PpCAD4突变株通过增加配子体中拟叶的数量,使得植株生物量增加,这表明CAD4在早期陆生植物的生长发育中起着重要作用。用灰霉菌侵染小立碗藓发现,0.5 d后野生型配子体菌丝入侵率为15%, cad4-ko菌丝入侵率为40%。侵染1 d后,Ppcad4-ko配子体菌丝侵入率是野生型的2倍。表明PpCAD4能够增加小立碗藓对真菌病原菌的抗性。 相似文献
3.
《西南农业学报》2020,(1)
【目的】为探明PpCASLUU3是否参与灰霉菌引起的小立碗藓中类过敏反应,构建PpCASLUU3-PTN182敲除载体,对早期登陆植物防卫防御的进化提供依据。【方法】根据同源重组的原理,以小立碗藓基因组DNA为模板,利用Primer 5设计的引物,扩增得到小立碗藓PpCASLUU3基因的上、下游同源臂基因片段。将上下游同源臂基因分别克隆到pMD-19T上,测序验证,使用EcoR I、EcoR V酶切含上游目的基因的pMD-19T获得上游目的基因片段,使用BamH I、Sma I酶切含下游目的基因的pMD-19T获得下游目的基因片段,同时酶切PTN182载体,经T_4-DNA连接酶连接,转入大肠杆菌感受态,筛选出阳性克隆,采用相同的方法,将下游臂连入PpCASLUU3.1-PTN182载体。【结果】经PCR检测、酶切验证,获得了完整的PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2敲除载体。经测序分析,插入序列PpCASLUU3.1和PpCASLUU3.2与未插入前相似度分别为100%和99.63%。【结论】PpCASLUU3-PTN182敲除载体构建成功。 相似文献
4.
目前,小立碗藓已经成为一种重要的功能基因组学研究的模式植物。将小立碗藓接种于含不同浓度潮霉素的BCDATG培养基上,观察小立碗藓对不同浓度潮霉素的敏感程度。结果表明:随着潮霉素浓度的增加,小立碗藓的生长受到不同程度地抑制。因此,潮霉素可以作为一种筛选标记对转基因小立碗藓进行筛选。 相似文献
5.
[目的]以模式植物小立碗藓为材料,研究脱落酸(ABA)在小立碗藓极端干旱胁迫中的作用机制.[方法]将培养6d的小立碗藓用50 μmol/L ABA预处理1d后(WA),再脱水处理1 d(WAD),然后复水30min (WAR).另外一组材料是将培养7d的小立碗藓(WT,未经ABA处理)直接脱水处理1 d(WD),然后复水30 min (WR).测定6个样品(WT,WA,WAD,WAR,WD,WR)叶绿素荧光光化学淬灭系数(qP,qL)、非光化学淬灭系数(qN)和光合系统Ⅱ的实际光合效率Y(Ⅱ),分析光合作用相关基因的表达.[结果]经ABA预处理的样品脱水-复水后(WAR)其qP、qL、qN、Y(Ⅱ)值可以恢复,而未经ABA预处理的样品脱水-复水后(WR)其qP、qL、Y(Ⅱ)值均为零.进一步分析光合作用相关基因的表达,结果表明,经ABA预处理的样品脱水-复水后(WAR)的光合作用相关基因psbH、psbN和petN相对于其脱水时的表达量上调,petB和petD下降幅度较小;而未经ABA预处理的样品脱水-复水后(WR)的光合作用相关基因psbH、psbN、petN、petB和petD相对于其脱水时的表达量均下调,而且psbH、petN、petB和petD四个基因下降幅度较大.[结论]在复水过程中,ABA可以促进小立碗藓光合作用的恢复,从而提高小立碗藓的抗旱能力. 相似文献
6.
《西南农业学报》2017,(9)
【目的】为利用绿色荧光蛋白基因(GFP)的表达情况优化聚乙二醇(PEG)介导的小立碗藓原生质体的转化体系及检测CAD1基因在细胞中的定位,构建小立碗藓GFP-CAD1-PTN182融合基因表达载体。【方法】用高保真酶获得GFP基因,通过双酶切GFP基因和CAD1-PTN182表达载体,将两片段洗脱回收,然后用T4-DNA连接酶将酶切产物在16℃条件下过夜连接。将连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞中,通过凝胶成像电泳的方法,挑选阳性克隆进行验证,并经过酶切验证和测序。【结果】序列对比相似度达100%,表明GFP-CAD1-PTN182融合基因表达载体构建成功。【结论】该载体的成功构建,为PEG介导小立碗藓原生质体转化体系的优化提供了便捷的检测手段,同时为进一步研究CAD1基因在细胞中的定位提供了理论依据。 相似文献
7.
小立碗藓(Physcomitrella patens)是研究植物发育的理想模式植物,也是目前发现的具有高频率同源重组特性的植物,其再生能力很强。此研究以生长7d的小立碗藓原丝体、培养0d的原生质体和再生2d的原生质体为材料,旨在了解小立碗藓细胞重新编程过程中染色体结构的动态变化。透射电镜观察发现原丝体染色体结构浓缩程度高;而当原丝体脱去细胞壁成原生质体状态时,异染色质开始解凝,染色体结构变得较为松散;原生质体再生2d时其染色体松散程度次之。通过进一步荧光定量PCR分析染色体重塑相关基因SWI/SNF的表达水平,发现这些基因在原生质体中表达量最高。 相似文献
8.
[目的]小立碗藓具有遗传背景清楚、活体观察方便、生活史短、再生能力强等特点,是研究发育的理想模式植物.[方法]应用0.5％的崩溃酶将生长7d的原丝体酶解,得到新鲜原生质体,先过滤再用8％的甘露醇洗涤,在含有为8％的甘露醇的BCDA液体培养基内培养2d和4d.采用新鲜原生质体、再生2d和再生4d的原生质体作材料,使用透射电镜,观察不同时期原生质体的细胞壁再生过程,并运用实时荧光定量PCR技术分析了细胞壁再生相关基因的表达.[结果]研究结果表明,原生质体培养2d后开始有微纤丝发生,在原生质体培养4d时形成细胞壁结构,细胞开始进行分裂.分析细胞壁再生相关基因的表达量,发现在新鲜原生质体中基因表达量最低,原生质体培养2d和培养4d后,基因表达量均比在新鲜原生质体中的表达量高.[结论]小立碗藓原生质体在液体培养基中培养2d微纤丝发生;原生质体培养4d形成完整的细胞壁结构. 相似文献
9.
为了检验棕榈垫是否能够成为苔藓立体绿化的载体,并且筛选出在此载体上能够生长的顶蒴藓类植物,本文将16种顶蒴藓类配子体碎片撒播于表面有薄层蛭石-泥炭土的棕榈垫上,4个月后,双色真藓(Bryum bicolor)、细叶莲叶藓(Rosulabryum capillare)、剑叶扭口藓(Barbula rufidula)、东亚砂藓(Racomitrum japonicum)和缺齿小石藓(Weissia edentula)5种藓类的配子体碎片形成绿色藓丛,并与立体绿化载体上的基质紧密结合。为进一步比较它们的生长和繁殖能力,测定了5种藓丛配子体的盖度、长度、配子体鲜重和干重等生长指标,运用根系分析软件(WinRhizo2000)定量地测定了单位面积内5种藓类的表面积、总体积等指标。基于以上指标,计算了反映5种藓类生长和繁殖能力的综合指数。按综合指数由高到低,5种藓类植物的排列次序为东亚砂藓、细叶莲叶藓、剑叶扭口藓、双色真藓、缺齿小石藓,它们可以作为今后屋顶和墙体立体绿化的可选种源。 相似文献
10.
11.
采用啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)F-box蛋白的氨基酸序列对稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）全基因组数据库进行Blastp分析,找到一个与之同源的、具有典型F-box结构域的蛋白编码基因,命名为Mofbox。采用同源重组原理,将构建的基因敲除载体转化稻瘟病菌,获得该基因缺失突变体2个。研究表明,在稻瘟病菌中,Mofbox缺失后可导致稻瘟病菌生长速率显著下降,分生孢子产孢量和附着胞形成率显著降低,对外源过氧化氢敏感,改变细胞壁完整性,同时降低对大麦和水稻敏感品种CO-39的致病性。 相似文献
12.
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以核盘菌菌株NGA4提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T : SsXYN载体上,用BamH I和Sal I 双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a : SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。 相似文献
14.
拟南芥At4g05060基因的酵母双杂交诱饵表达载体的构建、表达及自激活检测 总被引：1，自引：0，他引：1
为研究At4g05060基因功能,采用PCR扩增拟南芥VAMP(vesicle-associated membrane protein)家族基因At4g05060的ORF序列,定向克隆至酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7,经酶切鉴定并测序后将其转化至酵母Y187细胞;然后采用Western blotting技术分析At4g05060基因在酵母中的表达水平,通过缺陷型培养基培养进行自激活检测。结果表明,成功构建酵母诱饵表达载体pGBKT7-At4g05060,并在酵母细胞正确表达,表达产物对报告基因无自激活作用。 相似文献
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应用质粒pKD46介导的Red同源重组系统,以质粒pKD3为模板,设计irp2基因序列敲除引物,引物5'端有51 bp的拟敲除基因的同源臂,3 '端为扩增引物,扩增两侧含FRT位点的氯霉素抗性基因,通过第1次同源重组将拟敲除的irp2基因替换为氯霉素抗性基因,再通过重组酶质粒pCP20在FRT位点发生第2次同源重组,消除抗性基因.结果表明,利用该重组系统成功敲除了禽致病性大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因.为深入研究irp2基因在禽致病性大肠杆菌致病过程中所发挥的作用打下基础. 相似文献
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海岛棉具有优良的纤维品质,TCP蛋白参与细胞生长和增殖调控,本研究构建海岛棉GbTCP5基因沉默和过量表达植物表达载体。以GbTCP5基因pGEM-T Easy-GbTCP5质粒为模板进行PCR扩增,并将该基因构建到植物表达载体pCAMBIA3301中,利用冻融法转入农杆菌GV3101菌株,通过农杆菌浸染法转化拟南芥植株,初步证明已获得转化海岛棉GbTCP5基因的拟南芥。利用重叠PCR方法替换拟南芥AtMIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiRTCP5前体的植物表达载体amiRTCP5-pCAMBIA3301,为深入研究海岛棉GbTCP5基因的生物学功能奠定基础,为研究棉花纤维发育机制提供理论依据。 相似文献
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山葡萄苯丙胺酸解氨酶（PAL）是苯丙烷途径的关键酶,在果皮着色中能够调控花色苷合成途径。构建PAL基因原核表达重组质粒pET28a-PAL,并对重组蛋白表达条件进行优化,以山葡萄DNA扩增PAL并连接到pMD18-T,筛选得到阳性克隆后连接到pET28a原核表达载体上,重组质粒转化至E.coli BL21后经不同浓度的IPTG、不同诱导温度、不同诱导时间处理,通过DPS设计正交试验优化重组蛋白的表达条件,并将重组蛋白纯化。结果显示,正交试验不同处理下的蛋白表达差异显著（P<0.05）,诱导因素的影响程度从强到弱分别为IPTG浓度、温度和时间。IPTG诱导浓度对其影响最显著（P=0.015<0.05）,且IPTG浓度为0.6 mmol·L-1,诱导温度为22℃,诱导时间为5 h时,诱导重组蛋白PAL的效果最佳。成功构建其原核表达载体并使其在大肠杆菌中得到高效表达,为探究PAL蛋白的表达提供参考。 相似文献
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为了阐明ZmPRR73基因的生物学功能,构建诱饵表达载体pGBKT7-ZmPRR73，利用酵母双杂交技术，从长日照光照环境诱导的热带玉米自交系的cDNA文库中筛选与ZmPRR73互作的蛋白。结果显示：构建的诱饵载体pGBKT7-ZmPRR73对酵母菌株无毒性，且对报告基因无自激活活性，共鉴定出12个与ZmPRR73互作的候选蛋白。生物信息学分析表明，这些候选互作蛋白的功能涉及植物的转录调控、离子跨膜转运的调节、信号转导、电子传递链等多个方面，推测ZmPRR73蛋白与以上蛋白互作参与多个信号转导和代谢途径，研究结果补充和完善了ZmPRR73蛋白参与的调控途径，为进一步研究生物钟核心元件ZmPRR73的分子功能提供了新的分子证据。 相似文献
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杀鲑气单胞菌杀藻作用的初步研究 总被引：1，自引：1，他引：0
为了研究几丁质酶对硅藻杀灭作用,以杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)和其几丁质酶敲除菌为研究对象对牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)进行共培养并探究其作用差异。结果表明:杀鲑气单胞菌野生株和缺失株分别与牟氏角毛藻共培养48 h后,野生株对牟氏角毛藻的杀藻率达到9.18%,而缺失株无明显杀藻活性;通过扫描电镜进一步发现野生株细菌能够裂解牟氏角毛藻的细胞壁,而缺失株不能。结果证实杀鲑气单胞菌因具有几丁质酶而对藻类具有杀灭作用。 相似文献