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1.
《甘肃农业大学学报》2015,(5):100-105
以蒺藜苜蓿(Medicargo trunctula)幼果为试材,采用RT-PCR方法克隆到二氢黄酮还原酶(DFR)基因的cDNA片段.该片段全长1 018bp,与GenBank中已注册的DFR基因同源性为99.8%,编码334个氨基酸;构建DFR基因原核表达载体pETDFR,DFR在原核表达系统中得到了高效表达,获得预期大小(38.1ku)的酶蛋白分子.原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达蛋白的分子质量与预期一致. 相似文献
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芸薹属DFR基因家族RNA干扰载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)是类黄酮途径的一个关键酶,对种皮色泽和花色的形成具有重要作用。本研究从甘蓝型油菜克隆了600 bp(不计人工酶切位点)的芸薹属DFR基因家族的RNA干扰片段BDFRI,将其反义片段和正义片段分别插入到本课题组新近改造的植物RNAi平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区之间、间隔区与终止子之间,构建了11 400 bp的RNAi干扰载体pFGC5941M-BDFRI,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌菌株LBA4404中形成了工程菌株。此载体的构建为进一步研究DFR基因参与决定芸薹属种皮色素和茎叶彩色性状的分子机理和代谢调控奠定了基础。 相似文献
3.
根据玉米(Zea mays)Zmb ZIP的基因序列和植物表达载体pCAMBIA3301的多克隆位点设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,以质粒pGM-T-ZmbZIP为模板PCR扩增ZmbZIP基因片段,双酶切目的片段及载体,回收后连接,构建该基因的植物表达载体.结果表明,扩增出的ZmbZIP基因片段长度为894 bp.经PCR检测及测序鉴定,表明植物表达载体构建成功,为进一步研究该基因的功能奠定了基础. 相似文献
4.
花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及反义表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是控制植物籽粒中蛋白质/油脂含量比例的关键酶.本研究利用RT-PCR技术,克隆PEPCase基因的cDNA片段,并将克隆的PEPCase基因片段反向连接替代植物表达载体PBI121的GUS基因.从花生栽培品种荔蒲大花生中克隆获得编码PEPCase基因的cDNA片段(886 bp),测序结果显示其核苷酸序列与已报道的花生(EU391629)、棉花(AY008939)、大豆(D10717)、拟南芥(AY210895)、豌豆(D64037)PEPCase基因对应部分的同源性分别为99.77%、84.37%、81.54%、81.25%、78.71%.构建的反义表达载体中PEPCase基因由35S启动子所控制,将构建的反义表达载体命名为pBGPEP.为通过反义抑制技术提高花生含油量提供了基因及表达载体. 相似文献
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二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是花色素苷代谢途径中的关键酶之一.本研究利用PCR技术将观赏向日葵DFR底物结合区敲除,并将该区域中134位保守氨基酸天冬酰胺定点突变为天门冬氨酸和亮氨酸,最后获得已敲除底物结合区的基因KODFR以及定点突变的基因N134D和N134L,并成功构建KODFR、N134D和N134L基因的植物表达载体pCAM-KODFR、pCAM-N134D和pCAM-N134L. 相似文献
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根据植物中hpRNA(hairpin RNA)原理,选择GLDH基因cDNA序列同源性较低区域设计1对携带双酶切位点的特异引物,以不结球白菜‘苏州青’叶片为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆了GLDH基因片段。构建中间克隆载体,经过3次亚克隆将测序正确的GLDH基因片段分别以正向和反向两种形式插入到间隔基因YYT的两端,经鉴定已插入到植物表达载体中,成功地构建了干扰GLDH基因表达的RNAi植物双元表达载体pRNAi-GLDH,并将表达载体转化到农杆菌菌株LBA4404中,为深入研究GLDH基因功能提供有效的工具。 相似文献
7.
以白菜(Brassica campestris ssp.chinensis,syn.B.rapa ssp.chinensis)雄性不育相关基因BcMF3和BcMF4为沉默对象,利用绒毡层组织特异性的A9启动子,构建了反义RNA、RNA干涉和双价反义RNA植物表达载体。结果表明,经过一系列分子操作,获得了A9启动子和目的基因片段,并利用它们构建了5个基因沉默植物表达载体,可用于基因功能验证。 相似文献
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二氢黄酮还原酶基因植物表达载体构建及对烟草的遗传转化研究 总被引：1，自引：1，他引：0
以pBI121为基础载体,通过分步酶切连接分别构建组成型CaMV35S启动子、光合组织特异型PNZIP启动子驱动的DFR基因植物表达载体pBIDFR和pPNDFR;采用直接转化法将pBIDFR和pPNDFR导入根癌农杆菌菌株,采用pPNDFR/EHA105菌株对普通烟草进行了遗传转化研究.在Kanamycin选择压力下获得了烟草转化不定芽和完整植株,经过PCR鉴定,该DFR基因已成功导入烟草基因组中. 相似文献
9.
[目的]为了进一步探讨GhANS(花色素合成酶)基因的上调表达对彩色棉纤维色素合成的影响,构建了棉花GhANS基因的植物表达载体.[方法]利用Gateway技术的同源重组原理,将GhANS基因通过BP反应和LR反应分别重组到植物过表达载体pGWB17与干扰表达载体pANDA35HK中.[结果]经PCR和酶切鉴定,PCR扩增片段与酶切片段大小与预期结果相一致.[结论]基于Gateway技术的棉花GhANS基因的过表达载体和干扰表达载体已构建成功,为进一步研究该基因的功能及棉花的遗传转化奠定了基础. 相似文献
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[目的]构建紫花苜蓿MsCOL1基因植物的表达载体。[方法]根据紫花苜蓿CONSTANS类似基因MsCOL1基因(登录号:DQ661682)序列,设计含有酶切位点的一对特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,获得MsCOL1基因完整编码区DNA序列,并将目的片段插入表达载体pBI121的相应位置,构建植物表达载体35S∷MsCOL1,再利用农杆菌介导方法将35S∷MsCOL1转化到拟南芥中。[结果]分析测序结果显示,所获得克隆为插入目的片段的阳性克隆。经RT-PCR检测,证明转基因植株中MsCOL1基因能够顺利表达。[结论]该方法成功构建植物表达载体35S∷MsCOL1,并获得了转基因拟南芥植株。 相似文献
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为了验证二氢黄酮醇-4-还原酶基因(DFR)在杨树上的功能,明确DFR对抗病物质儿茶素合成的影响,利用抗病基因防治树木溃疡病提供候选基因。以接种欧美杨细菌性溃疡病菌后6 d的一年生中林46杨树苗干的树皮为材料,利用RT-PCR技术克隆DFR基因的ORF序列,并构建DFR的反义表达载体anti-p BI121-DFR。采用农杆菌介导叶盘法转化84K杨,获得了转反义DFR基因的84K杨4株。用高效液相色谱法检测转基因植株叶片中的儿茶素质量分数,结果显示,4株转反义DFR株其内源儿茶素质量分数分别为0.97、2.4、1.6和0.87 ng/g,与84K野生型植株中儿茶素质量分数(8.9 ng/g)相比显著降低。上述结果表明DFR基因参与了杨树类黄酮生物合成途径,该基因与儿茶素的合成有关。 相似文献
12.
[目的]研究唇形亚纲植物中花色素苷合成的关键酶—DFR的分子进化特性。[方法]基于Genbank数据库上发表的唇形亚纲植物DFR氨基酸序列和cDNA序列,利用生物信息学软件对其进行了分子进化分析。[结果]基于DFR氨基酸序列的系统发育树显示,唇形亚纲植物和百合亚纲植物分为2支,大部分同科植物聚在一起,这与形态学上的物种发育关系基本吻合;MEGA、DNAsp和PAML的选择性压力预测结果均显示,DFR基因在唇形亚纲植物进化过程中经历了强烈的纯化选择压力。[结论]该研究可为研究DFR的酶学特性花色素苷生物合成的分子机制等奠定基础。 相似文献
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甜樱桃DFR基因内含子2和内含子3的多态性 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】研究70个甜樱桃品种DFR基因多态性与果皮颜色的相关性。【方法】通过DNA序列分析,以不同果皮颜色的10个甜樱桃品种（Prunus avium L.）为材料,检测DFR基因的多态性。根据多态性出现的位点设计特异引物,通过PCR扩增检测70个甜樱桃品种DFR基因的多态性。【结果】获得甜樱桃DFR基因约1 kb的片段,测序结果用BLAST分析发现,其核苷酸序列与樱桃李（Prunus cerasifera）的核苷酸相似性为80 %,预测的氨基酸序列与已知的甜樱桃（P. avium）DFR氨基酸序列相似性达99 %。该片段由3个外显子和3个内含子组成,2个多态性位点分别在内含子2和内含子3上。在黄色、黄底红晕和红色果皮3个组的70个甜樱桃品种中发现3个单倍型,共5种单倍型组合。通过SAS 9.0软件分析发现,所检测到的DFR基因的等位基因频率在黄底红晕果皮品种组和红色品种果皮组中的分布无显著差异。【结论】本研究在甜樱桃DFR基因座上得到2个差异位点,分别在内含子2和内含子3内,其优势基因频率依次为：0.864和0.679;但未发现DFR基因内含子2和内含子3的多态性与果皮颜色之间存在直接关系。 相似文献
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采用同源克隆的方法从荔枝果皮中克隆得到一个二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）基因,该基因开放阅读框全长1062bp,编码353个氨基酸．基因组扩增得到长度为2321 bp的片段,分析发现：该基因含有5个内含子,分别在119-255、426-1158、1353-1470、1632-1819、2013-2095bp之间．通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与山葡萄、海棠和山竹子等果树具有较近的亲缘关系． 相似文献
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【目的】花色苷是一类通过类黄酮途径合成的水溶性次生代谢产物,既能使植物的不同器官呈现红、紫、蓝等颜色,还有利于人体健康。紫茄富含花色苷,但是有关茄萼花色苷生物合成的分子机制还不是很清楚。本研究旨在通过克隆茄萼花色苷合成相关基因DFR和MYB,测定其在不同发育时期不同颜色茄萼中的表达量,探究DFR和MYB在茄萼花色苷合成中的作用。【方法】选用绿萼和紫萼长茄(Solanum melongena L.)果萼为试材,测定不同p H条件下茄萼花色苷含量;通过RACE方法分离克隆DFR和MYB cDNA全长序列,分析DFR和MYB的保守结构域及序列特征;分别对DFR和MYB及其同源蛋白序列进行系统进化分析,构建系统进化树来进一步分析鉴定基因;使用Ex PASy网站提供的在线分析软件SOPMA预测蛋白质二级结构;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在不同发育阶段果萼中的表达情况。【结果】从绿萼和紫萼长茄果萼中克隆了DFR和MYB片段,分别命名为ouSmDFR、dongSmDFR和ouSmMYB、dongSmMYB,Gen Bank登录号分别为:KX224250、KX224251和KX224253、KX224254。ouSmDFR和dongSmDFR全长分别为1 285 bp和1 249 bp,开放阅读框为858 bp和864 bp,分别编码285个和287个氨基酸;ouSmMYB和dongSmMYB全长分别为969 bp和959 bp,开放阅读框均为462 bp,编码153个氨基酸。蛋白质二级结构分析表明α-螺旋和无规则卷曲均为两个DFR蛋白和两个MYB蛋白的主要二级结构元件。序列比对表明DFR蛋白具有NADPH结构域(NADPH binding domain)和底物特异性结合结构域(Substrate specific binding domain),属于NADB-Rossmann超基因家族;MYB蛋白属于R2R3-MYB转录因子,具有R2、R3两个MYB结构域和b HLH结合域。ouSmDFR和dongSmDFR与St DFR和Sl DFR具有相对较高的同源性;ouSmMYB和dongSmMYB与Es MYB同源性较高。花色苷含量测定显示,紫萼果茄萼花色苷含量较高且随着果实的发育成熟而逐渐增加;而绿萼茄萼几乎检测不到花色苷。荧光实时定量PCR分析表明,DFR和MYB在紫萼长茄果萼中表达量均远高于绿萼长茄;从初蕾期到盛花期,紫萼长茄果萼中DFR和MYB表达量逐渐升高,而绿萼长茄则几乎没有变化,与两个品种茄萼颜色变化相一致。【结论】ouSmDFR和dongSmDFR属于NADB-Rossmann超基因家族,ouSmMYB和dongSmMYB为典型R2R3-MYB转录因子,DFR和MYB在紫萼长茄果萼中表达明显高于绿萼长茄。推测DFR和MYB在茄萼呈色中发挥作用,并且参与花色苷生物合成。 相似文献
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金荞麦二氢黄酮醇4-还原酶基因（FdDFR1）的克隆及序列分析 总被引：5，自引：2，他引：3
【目的】克隆金荞麦二氢黄酮醇4-还原酶基因（FdDFR1）,分析其序列特征。【方法】利用同源克隆的原理,采用RACE结合cDNA文库筛选的方法,从金荞麦cDNA文库中克隆DFR基因（FdDFR1）;对其序列进行生物信息学分析和Southern杂交检测。【结果】克隆到一个DFR蛋白基因（FdDFR1）,通过Southern杂交分析,推测在金荞麦基因组中DFR基因是1～2个基因的小家族,FdDFR1是单拷贝基因;FdDFR1基因编码一个长341个氨基酸的蛋白质,在N端存在一个NADP结合位点“VTGASGFVGSWLVMRLLEHGY”,还存在一个底物结合特异性决定的氨基酸基序“TVNVEEKQKPVYDETCWSDVDFCRRV”。【结论】首次从金荞麦中克隆到类黄酮代谢的中期关键酶基因（FdDFR1）,它具有DFR同源基因的典型特征。 相似文献