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1.
十字花科植物CYP86MF同源基因的克隆及特征分析 总被引：3，自引：0，他引：3
用保守的特异引物进行PCR扩增，并结合RACE技术，从大白菜(Brassicacampestris L．)品种黄芽14，萝卜(Raphanus sativus L．)品种圆白和诸葛菜(Orychophrogmus violaceus)3个材料中扩增到3个完整的cDNA全长，分别命名为Bc-CYP86MF，RsCYP86MF和OvCYP86MF，它们的cDNA全长分别为1854，1818和1876bp，分别编码524，526和534个氨基酸残基。将所推导的氨基酸序列与数据库中已知基因进行排序，发现它们与拟南芥CYP86家族所有成员的氨基酸相似性都大于38％，可将它们归为细胞色素CYP86基因家族。BcCYP86MF和RsCYP86MF与CYP86C4亚家族氨基酸同源性均大于55％，则可归为CYP86C4亚家族，而OvCYP86MF与CYP86C3的同源性最高，为86．5％，应归为CYP86C3亚家族。根据氨基酸序列的排序结果构建的系统树表明，CYP450基因的氨基酸序列进化程度与物种的亲缘关系的远近相吻合。对蛋白二级结构预测结果发现，它们都具有细胞色素P450典型的保守结构域FNAGPRLCIG，而且氨基酸组成也很相似。 相似文献
2.
木质素是梨(Pyrus)石细胞的重要成分之一,木质素合成代谢对石细胞形成发育有着重要影响.肉桂酸4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H,EC l.14.13.11)是细胞色素单加氧酶超家族中CYP73A亚家族的一员,同时为木质素合成代谢中的一个关键酶.本研究从砀山酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Danshan Su)果实中克隆出一条肉桂酸4-羟化酶基因的全长cDNA序列,命名为PbC4H,GenBank登录号为:KF663548.PbC4H全长1 764 bp,具有1 515bp的ORF,编码504个氨基酸.PbC4H与多个物种C4H基因编码的氨基酸序列具有较高的同源性,说明其在进化过程中较为保守.结构域分析表明,PbC4H具有跨膜结构域和典型的细胞色素P450结构域特征.qRT-PCR分析发现在梨果实发育的不同时期,PbC4H基因表达量呈现先增加后下降的趋势,其中在花后55 d达到最高.构建了PbC4H原核表达载体pET-32a-PbC4H,在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21菌株中诱导表达出PbC4H融合蛋白.亚细胞定位表明PbC4H蛋白定位于细胞膜上.本研究结果为利用分子生物学技术调控梨木质素的合成和石细胞的发育提供了基础资料. 相似文献
3.
细胞色素P450 (cytochrome P450,CYP450)是高等植物中最大的酶蛋白家族之一,广泛参与植物的次生代谢和抗逆生理.本研究采用同源克隆和cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNAends,RACE)技术,获得苦荞(Fagopyrum tataricum) CYP81家族同源基因FtP450-R4 (GenBank登录号:KM271986).FtP450-R4 cDNA全长1770bp,5'-UTR为49 bp,3'-UTR为194bp,ORF为l 527 bp,其ORF序列可编码508个氨基酸残基的蛋白.生物信息学分析表明,FtP450-R4蛋白通过N-端4～24位氨基酸残基定位于内质网,与F3'H (flavonoid 3'-hydroxylase)、I2'H (isoflavone 2'-hydroxylase)和其他CYP450的同源性在44％～46％之间;多重序列比对显示,FtP450-R4具有CYP450中经典的基序和保守序列,但不含F3'H的特征基序(GGEK);系统进化树分析显示,FtP450-R4与拟南芥(Arabidopsis thaliana) CYP81家族和I2'H聚为一大簇,说明其可能参与苦荞黄酮类化合物的羟化或对逆境胁迫的应答.UV-B、寒冷和干旱均能引起FtP450-R4在苦养子叶中表达量的显著变化,而在胚轴中其表达量变化不显著.利用大肠杆菌(Escherchia coli) BL21 (DE3)菌株对FtP450-R4蛋白进行了可溶性表达,活性鉴定表明,重组FtP450-R4蛋白能以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH)和山奈酚为底物进行酶促反应,具有生物学活性.本研究可为了解CYP450在黄酮合成代谢中的功能,明确苦荞黄酮代谢调控的分子机制提供了基础资料. 相似文献
4.
本研究以15DPA棕色棉及其白色近等基因系为材料,蛋白质双向凝胶电泳结合质谱分析,鉴定出其中一个差异表达的蛋白为花色素合成酶(ANS)。以15DPA棕色棉纤维细胞cDNA为模板,电子克隆获得了编码该蛋白基因的全长cDNA序列,序列分析发现,该基因的开放阅读框为1062 bp,编码354个氨基酸,属于花色素还原酶2-酮戊二酸加氧酶亚家族,将该基因命名为GhANS。构建GhANS基因GFP融合植物表达载体转化烟草,荧光共聚焦显微镜观察发现GhANS基因定位于烟草细胞质内。实时荧光定量PCR分析表明,GhANS基因在棉花中组成型表达,该基因在纤维细胞发育的各个时期在棕色棉中表达量均高于其白色近等基因系,推测GhANS基因在棕色棉纤维色素合成过程中起重要作用。 相似文献
5.
植物寄生线虫食道腺分泌蛋白在寄生致病过程中起到至关重要的作用.用RT-PCR结合RACE的方法从马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)中克隆了一个类毒液过敏原蛋白新基因Dd-vap-1.Dd-vap-1 cDNA全长1346bp,开放阅读框的长度为l 209 bp,推导编码一个含有402个氨基酸的蛋白序列(GenBank登录号JQ341057).推导蛋白Dd-VAP-1预测分子量为45.3 kD,等电点为6.68,序列比对分析表明,Dd-VAP-1为富含半胱氨酸分泌蛋白家族成员.原位杂交结果显示,Dd-vap-1在马铃薯腐烂茎线虫的亚腹食道腺细胞特异表达,推测该基因在马铃薯腐烂茎线虫侵染甘薯的早期阶段起重要的作用. 相似文献
6.
细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)是生物体内氧化系统中的电子供体,在细胞色素P450介导的氧化还原反应中起限速作用,是氧化反应中的关键酶。本研究根据已经报道的其他植物的CPR基因设计简并引物,并在洋甘菊(Matricaria recutita L.)中克隆CPR基因的部分片段,然后通过RACE扩增得到CPR基因全长。结果表明,克隆得到洋甘菊的CPR基因,提交至GenBank,得到登录号KJ004519,其cDNA全长2 272 bp,包含2 106 bp的编码区,翻译701个氨基酸序列;生物信息学分析表明,洋甘菊与青蒿(Artemisia annua)的亲缘关系最近,CPR基因氨基酸序列有94%的相似性,CPR蛋白质结构包括结合P450结构域和辅因子黄素腺嘌呤二核甘酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)和黄素单核甘酸(flavin mononucleotide,FAM)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP)结构域;通过qRT-PCR检测CPR基因在洋甘菊开花阶段舌状花冠、管状花冠、茎和叶中的表达量,结果表明,CPR mRNA转录本积累量在管状花冠中表达量最高,是叶中表达量的20多倍,在舌状花冠和茎中有微量表达量。本研究首次克隆了洋甘菊中CPR基因,CPR基因是植物萜类的氧化修饰过程中关键酶,为进一步研究细胞色素P450氧化酶系在洋甘菊中萜类的生物合成途径中的具体作用提供了基础资料。 相似文献
7.
甾醇14α-去甲基化酶(sterol 14α-demethylase,CYP51)是细胞色素P450家族的重要成员之一。基于从巴西橡胶(Hevea brasiliensis)胶乳转录组文库分离出的目的基因,利用实时荧光定量PCR方法研究橡胶树在不同机械损伤(割次)中和外施乙烯利和茉莉酸后,其胶乳中Hb CYP51 m RNA表达差异,探讨不同刺激方式和水平对Hb CYP51基因表达的影响。BLAST结果表明,本研究克隆了1个与细胞色素P450相关的基因,该基因与毛果杨(Populus trichocarpa)(90%)和苹果(Malus domestica)(88%)中已报道的CYP51同源性最高,命名为Hb CYP51(Gen Bank登录号:KM203677),含有3个外显子和2个内含子,其c DNA全长2 305 bp,包括1 461 bp的开放阅读框(ORF),推测编码1个含486个氨基酸的蛋白。定量RT-PCR分析表明,胶乳Hb CYP51基因是诱导型表达,并被割胶、乙烯利和茉莉酸调控表达,其中受24 h茉莉酸诱导上调表达最显著(P0.01),首次证明了割胶、乙烯利和茉莉酸可激活Hb CYP51的表达。相关性分析表明,割胶刀次与Hb CYP51基因的表达量和胶乳产量均呈极显著正相关(P0.01),而胶乳产量与Hb CYP51基因的表达量无显著相关。研究结果初步说明,Hb CYP51可能是巴西橡胶的重要防御因子,直接或间接参与对割胶和乙烯利的防御反应。 相似文献
8.
细胞色素P450属于一种含亚铁血红素单加氧酶的超基因家族,在植物多种代谢途径与防御反应中起着重要作用。为探究细胞色素P450基因在高羊茅中的表达模式,本研究采用cDNA末端快速扩增技术从高羊茅叶片中克隆了细胞色素P450基因,命名为FaP450。FaP450全长1 737 bp,含1 437 bp的开放阅读框,共编码478个氨基酸,具有P450基因家族典型的P450结构域。系统进化树分析表明,高羊茅FaP450与禾本科植物小麦、山羊草的P450蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR表明,高羊茅FaP450基因受干旱、高温、氮胁迫及盐胁迫的诱导表达上调,表明该基因与非生物胁迫的抗性相关。构建FaP450超量表达载体,利用农杆菌侵染法转化拟南芥,对其进行低氮胁迫,发现低氮胁迫下FaP450基因过量表达植株的鲜重与根长显著高于野生型,表明FaP450基因的超量表达可以增强拟南芥对低氮的适应性。本研究为深入探索P450基因家族在牧草生长发育与抗逆功能的研究奠定了理论基础。 相似文献
9.
油菜叶片衰老相关基因的分离细胞色素P450 cDNA的克隆和序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
通过绿叶和衰老叶片cDNA的缩减杂交和差别筛选,富集并分离了缩减cDNA文库中与油菜叶片衰老有关的基因片段.以目的基因片段为探针,通过筛选油菜衰老叶片的cDNA文库,分离了油菜叶片衰老阶段表达增强的全长cDNA LSC46.DNA序列分析结果表明,LSC46可读框架全长由1509个碱基组成,可以编码503个氨基酸残基,它的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与拟南芥菜依赖于单加氧酶的细胞色素P450的相应序列相比,分别有84.23%和83.50%的同源性. 相似文献
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利用甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hübner）围食膜多克隆抗体免疫筛选草地螟（Loxostege sticticalis L．）中肠cDNA表达文库,得到编码运载蛋白LstiSLC25的全长cDNA克隆。该cDNA克隆全长1399bp(GenBank登录号EU924506),开放阅读框长897 bp,编码299个氨基酸,预测分子量和等电点分别为32.1kD和9.46。序列含有三个典型的溶质运转重复结构,具有溶质运载蛋白家族的典型特征。将该基因与pET30载体重组后,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌中获得了表达。 相似文献
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紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及功能鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank已公布的植物谷胱甘肽硫转移酶基因EST序列，设计引物利用3’和5’RACE方法，获得紫杆柽柳GST基因(TaGST)全长cDNA序列，全长为1175 bp，开放读码区672 bp, 编码224个氨基酸。其所编码的蛋白与大豆的GST10同源性最高为48%。利用pET-28a（+）构建了紫杆柽柳GST基因的原核表达载体，转入BL21大肠杆菌进行了原核表达。诱导表达蛋白的SDS-PAGE检测表明, 所表达的蛋白分子量约为26 kD，与预测的分子量大小一致。初步的酶学活性的检测表明所克隆的基因编码的肽段具有催化GST蛋白通用底物CDNB和GSH反应的活性。 相似文献
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加州鲈卵泡抑素cDNA的克隆、分析和原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
卵泡抑素是TGF-β超家族中一些成员的抑制蛋白，具有促肌肉生长的作用。采用RT-PCR和RACE技术从加州鲈成鱼卵巢总RNA中扩增得到卵泡抑素cDNA，序列分析结果表明，加州鲈卵泡抑素cDNA全长1444bp，包括开放阅读框966bp，5¢非编码区82bp，3¢非编码区359bp。该基因编码321个氨基酸，其中信号肽31个氨基酸，成熟肽290个氨基酸，成熟蛋白由四个功能区组成，分别为：N-domain、Domain Ⅰ、Domain Ⅱ和Domain Ⅲ，其中N-domain具有与TGF-β超家族中一些成员特异性结合的结构，可抑制这些蛋白发挥作用。将加州鲈卵泡抑素氨基酸序列与红鳍东方鲀、草鱼、斑马鱼、大西洋鲑和斑点叉尾鮰比较，同源性分别为97％、89％、88％、88％和70％，其中N-domain氨基酸序列的保守性更高一些，与红鳍东方鲀、草鱼、斑马鱼、大西洋鲑、斑点叉尾鮰、非洲爪蟾、人、猪、大鼠、鸡的相比较，同源性为75%～100％。为获得重组卵泡抑素蛋白，将成熟肽cDNA插入表达载体pET-32a(+)，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测，结果检测到一分子量约52kD的特异蛋白带，与预期大小一致，Western blot检测到表达产物表明成功获得了卵泡抑素的融合蛋白。加州鲈卵泡抑素cDNA序列和重组蛋白的获得为进一步研究鱼类卵泡抑素的促肌肉生长奠定了基础。 相似文献
14.
趋化因子家族是一类能诱导白细胞激活和迁移的趋化性细胞因子家族,是鱼类先天免疫的重要组成部分.CC类家族是趋化因子家族中最大的家族之一.为研究鲤CC类家族成员的组织表达和进化模式,以及进一步研究鲤CC类趋化因子的免疫调控机制,本研究选择该家族其中的一个基因,CCL-C5a样基因,根据EST序列结合RACE方法从鲤(Cyprinus carpio)脾脏中克降了该基因的全长cDNA序列(GenBank登录号:JQ026408).该序列全长830 bp,5端非翻译区174 bp,3端非翻译区296 bp,开放阅读框360 bp,编码一个由119个氨基酸组成的蛋白.结构域分析发现,该蛋白质含有分泌信弓肽和保守的趋化因子结构域;Gene Ontology注释该基因参与免疫细胞迁移的生物学过程.CCL-C5a基因在鲤10个组织中表达,其中在脾和肝的表达量最高.脂多糖刺激鲤外周血白细胞和头肾白细胞后,该基因表达量出现显著上升.氨基酸序列保守性分析表明,鲤CCL-C5a样趋化因子与斑马鱼(Danio rerio)的同源性最高,为61％,与蓝鲶(Ictalurus futrcatus)、沟鲶(Ictalurusp unctatus)和大西洋鲑(Salmo salar)的同源性分别为47％、47％和42％;与人(Homo sapiens)CCL19蛋白的同源性为37％.适应性进化分析发现,鲤与斑马鱼CCL-C5a的Ka/Ks小于1,说明CCL-C5a基因在鱼类的进化过程受到负选择压作用.本研究结果表明,鲤CCL-C5a主要在免疫器官上高表达,并受到脂多糖诱导表达上升;同时该基因在鱼类中受到负选择作用.这些结果提示CCL-C5a可能是一个与免疫相关的基因. 相似文献
15.
采用比较基因组学和RT-PCR方法，根据人和小鼠SMAF1基因的保守序列，设计简并引物，克隆了猪SMAF1基因的cDNA序列。所克隆片断全长256bp（GeneBank登录号 DQ191892），包括一个编码了81个氨基酸的完整编码区，该序列与人和小鼠的SMAF1基因的相似性分别为86%和78％，预测的氨基酸序列与人、小鼠、大鼠和牛的相似性分别为81％、67％、70%和84%。猪SMAF1基因在脂肪组织中高丰度表达，在4月龄瘦肉型猪（大白猪）脂肪组织中的表达量显著低于脂肪型猪（梅山猪）（P＜0.05）。本研究结果表明，猪SMAF1基因可能具有和其它物种SMAF1基因相似的功能，推测其在脂肪细胞发生和/或脂肪细胞功能中具有重要的调控作用。 相似文献
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用保守的特异引物进行PCR扩增,结合RACE技术,分离和克隆到了总状毛霉(Mucorracemosus)甲壳素脱乙酰酶(CDA)的全长cDNA,并进行了全序列测定,提交GenBank登陆号DQ538514。研究结果表明:(1)总状毛霉CDA基因全长为1506bp,包括67bp5'非翻译区,1344bp阅读框以及95bp3'非翻译区,3'非翻译区包含Poly(A)加尾信号AATAAA。总状毛霉的CDA基因共编码448个氨基酸,在该基因中部还包含一个144氨基酸的多糖脱乙酰酶结构域,约占CDA基因全长的32%。(2)总状毛霉CDA基因与其它相近种米根霉(Rhizopusoryzae)、卷柄根霉(Rhizopuscircinans)的CDA1和CDA2、鲁氏毛霉(Mucorrouxii)、卵形孢球托霉(Gongronellabutleri)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、布拉克须霉(Phycomycesblakesleeanus)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的CDA1和CDA2的基因序列同源性分别为:75%、58%、56%、56%、48%、39%、39%、17%和16%;相应的氨基酸序列的同源性分别为:69%、57%、59%、55%、47%、30%、32%、18%和21%。表明CDA基因在不同的真菌中有着不同的亲缘关系。(3)根据总状毛霉CDA基因的氨基酸序列构建的不同真菌的系统树,与采用经典分类法构建的系统树基本一致。(4)通过生物信息学的方法,预测该基因所编码的蛋白质三级结构,验证了该蛋白质具有甲壳素脱乙酰酶完整的功能性结构,并包含一个多糖脱乙酰酶结构域,两者具有相似的空间结构。 相似文献
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用保守的特异引物进行PCR扩增，并结合RACE技术，分离到了总状毛霉（Mucor racemosus）甲壳素脱乙酰酶(CDA)基因，并进行了全序列测定，并提交GeneBank（DQ538514）。研究结果表明：（1）总状毛霉CDA基因全长为1506 bp，包括67 bp 5’非翻译区，1357 bp阅读框以及82bp 3’非翻译区，3’非翻译区包含Poly (A) 加尾信号AATAAA。总状毛霉的CDA基因共编码448个氨基酸，在该基因中部还包含一个144氨基酸的多糖脱乙酰酶结构域，约占CDA基因全长的32%。（2）总状毛霉CDA基因与其它相近种米根霉（Rhizopus oryzae）、卷柄根霉（Rhizopus circinans）的CDA1和CDA2、鲁氏毛霉（Mucor rouxii）、卵形孢球托霉（Gongronella butleri）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、布拉克须霉（Phycomyces blakesleeanus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的CDA1和CDA2的基因序列同源性分别为：75%、58%、56%、56%、48%、39%、39%、17%和16%；相应的氨基酸序列的同源性分别为：69.0%、57%、59%、55%、47%、30%、32%、18%、21%。表明CDA基因在不同的真菌中有较高的同源性。（3）根据总状毛霉CDA基因的氨基酸序列，构建的不同真菌的系统树，与采用经典分类法构建的系统树基本一致。（4）通过生物信息学的方法，预测该基因所编码的蛋白质三级结构，验证了该蛋白质具有甲壳素脱乙酰酶完整的功能性结构，并包含一个含多糖脱乙酰酶结构域，两者具有相似的空间结构。 相似文献
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摘要：利用sp18 mAb筛选小鼠睾丸λgt11-cDNA表达文库,命名为sp18（GenBank登录号：AF129872）的阳性克隆由 1 468 bp组成,开放阅读框（open reading frame, ORF）长约429 bp,编码142个氨基酸。起始密码ATG位于第694 bp,终止密码位于第1 122 bp,polyA位于1 245~1 250 bp。核苷酸同源性分析表明,sp18 cDNA的10~651 bp与人视神经Hr44的532~ 1 173 bp、sp18 cDNA的10~816 bp、864~1 444 bp与牛视神经Hr44的1 408~2 208 bp、2 250~2 309 bp的cDNA序列有很高的同源性, 高达98%。推测sp18基因可能是生殖系统存在的一种新基因。sp18编码蛋白的理论分子量约为15.7 kD,有8个N-糖基化位点和12个O-糖基化位点,亲水性分析表明sp18多肽是一种精子跨膜蛋白,跨膜区位于第17~33氨基酸处。将sp18 cDNA亚克隆到原核表达载体pET-30a(+),在E. coli BL21（DE3）中得到诱导表达,其表观分子量约为16.5 kD,表达量约占菌体总蛋白的32%。Western blot分析表明sp18 mAb能识别重组的sp18膜蛋白,表明重组蛋白具有免疫原性,为进一步研究sp18基因的功能打下了基础。 相似文献
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小金海棠S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（MxSAMS）的克隆和表达分析 总被引：1，自引：1，他引：0
从本实验室建立的小金海棠缺铁差减文库中分离出一个cDNA片段,在GenBank中发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因具有90%的同源性。利用RACE技术成功地获得小金海棠（Malus xiaojinensis）SAMS基因(MxSAMS)的cDNA全长序列（GenBank登录号：EU639408）,该基因cDNA全长1 479 bp,最大开放阅读框1 176 bp,编码392个氨基酸,酶蛋白理论分子量为42.99 kD;与其它植物的蛋白质氨基酸序列同源性在88.1%~92.6%之间。推测的MxSAMS蛋白质三级结构包含3个保守结构域和一个保守的ATP结合位点GAGDQG。Southern 杂交显示,MxSAMS基因在小金海棠基因组中是单拷贝的。半定量RT-PCR结果表明,该基因在小金海棠的根和叶中均受缺铁胁迫诱导增强表达。 相似文献
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克隆了猪MYL4基因的cDNA序列,并利用生物信息学方法进行验证。所得cDNA序列全长1105bp,包含一个完整的开放阅读框,编码197个氨基酸。序列分析表明,该基因与已报道的狗、人、黑猩猩和恒河猴等物种的MYL4基因高度同源,氨基酸序列同源性分别为98.4%、95.9%、95.4%和95.4%。该基因编码的蛋白具有EFH和FRQ1保守功能域。荧光定量分析该基因在猪胚胎骨骼肌（妊娠33 、65 和90 天）中的表达规律,发现MYL4基因在通城猪和长白猪中呈波浪式表达模式,在妊娠第33 天时中外猪品种间无显著差异,但在65 和90 天时长白猪中显著高于通城猪。 相似文献