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瘤胃微生物总DNA提取方法的比较 总被引：6，自引：0，他引：6
目前如何获得完整的瘤胃微生物总DNA是对瘤胃微生物在分子水平研究中关键的一步。瘤胃微生物总DNA分子片段很大,大概在15kb~20kb,因此需要选择一种合适的提取方法来获得完整的总DNA片段。笔者研究采用物理方法如玻璃珠研磨震荡法、反复冻融法、超声波破碎法、液氮研磨法等,化学方法如表面活性剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）、溴化十六烷三甲基铵（Cetyltrimethyl Ammonium Bromide,CTAB等）,酶解法（溶菌酶、蛋白酶K等）相结合,并对其进行比较,选择最佳的提取方法,使其符合以后PCR扩增要求以及其它后续研究工作。试验结果表明用玻璃珠研磨震荡加CTAB提取液的方法、反复冻融加SDS提取液的方法提取的瘤胃微生物总DNA的效果高于其它方法,并且通过电泳以及PCR检测,所提取的DNA的量适于进一步的分子生物学研究。 相似文献
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农杆菌感染桑幼苗的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
农杆菌A-208接种桑幼苗以其致瘤基因作标记,调查接种部位冠瘿瘤的有无和大小,以此为桑苗对农杆菌敏感性的参考指标;用不同菌体对桑幼苗进行接种试验,探明了菌液接种的效果好于菌体;用农杆菌A-110株(L=BA4404／pIG121-Hm)菌液对桑幼苗子叶腋隙进行剌伤接种,由接种部位长出的桑芽表型异常。取处理株叶片基因组DNA进行分子生物学鉴定。结果显示：以处理株基因组DNA为模板,经PCR反应后得到特异性扩增片段,该片段用SalI酶解,酶切产物与预计大小完全相符;用GUS基因作探针进行Southem杂交和用Kan基因作探针对基因组DNA进行Southem杂交,均获得较强的杂交信号;取畸形株扦插后,用组织化学染色法对扦插苗幼根进行显色反应,幼根出现深兰色区段,这一结果表明GUS基因在桑苗中得到部分表达。 相似文献
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植物果实特异性启动子E8基因的克隆 总被引：2，自引：0，他引：2
采用高盐低pH值法、分步离心法、SDS法、CTAB法、改良CTAB法提取毛粉802番茄幼苗基因组DNA,其中改良CTAB法提取的DNA效果最好,以此DNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增,得到了预期大小的片段,将目的片段回收,克隆进pMD18-T Simple Vector载体,经PCR及酶切检测具有与目标片段长度相符的插入片段,构建的重组pMD18-E8载体经测序结果分析显示,番茄果实特异性E8启动子序列具有高度保守性,与GenBank上发表的E81.1启动子同源性为99.1%,说明成功获得了果实特异性E8启动子基因,为实现外源基因在转基因桃果实中特异性表达做准备。 相似文献
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为了更有效地提取苜蓿多糖,利用响应面法优化确立提取苜蓿多糖的最佳工艺条件。试验用超声波辅助法水提苜蓿多糖,采用RSA中的Plackett-burman设计,筛选试验因素,得出了最佳提取条件:超声波提取时间为16.69min,料液比为1∶37.4,提取温度为74.5℃,最佳得率为6.19%。该提取工艺产率稳定且效率高于普通水提法。 相似文献
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响应面法优化酶-超声波辅助同步提取鸭骨素工艺 总被引：1，自引：0，他引：1
以新鲜鸭骨为原料,采用酶-超声波辅助同步提取鸭骨素,并以可溶性固形物和蛋白质含量为考察指标,在单因素试验的基础上采用响应面法优化鸭骨素提取工艺条件。结果表明,酶-超声波辅助同步提取鸭骨素的最佳工艺条件为:超声温度62℃,超声功率248 W,超声时间5.1 h,酶添加量1.34%。此条件下鸭骨素提取液中可溶性固形物含量和蛋白质含量分别为(25.8±0.047)°Bx和(20.9±0.018)g·100 g-1。采用酶-超声波辅助同步提取的鸭骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量极显著高于单一酶解法、微波提取法和超声波提取法(P0.01)。 相似文献
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《农产品加工．学刊》2016,(13)
为提高香椿叶总三萜提取率,采用超声波细胞破碎仪对香椿叶中的总三萜进行提取研究,通过单因素试验和正交试验确定最佳工艺参数。通过正交试验得出超声强化提取香椿叶总三萜的最佳提取工艺参数为乙醇体积分数80%,提取时间35 min,料液比1∶60,超声功率700 W,超声工作间歇比3S/1S,在此条件下提取量可达到19.26 mg/g。试验结果表明,超声波法强化提取香椿叶中的总三萜可以提高提取率,为香椿资源的合理开发提供理论依据。 相似文献
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小麦叶肉细胞原生质体制备参数解析及在基因瞬时表达上的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
《华北农学报》2015,(6)
为建立一套稳定高效的小麦叶肉细胞原生质体制备技术流程,以小麦幼苗叶片为材料,采用正交和随机设计试验分析了影响小麦叶肉细胞原生质体产量的制备因素。结果发现,酶解条件相关因素对制备原生质体产量的影响由大到小依次为酶解液甘露醇浓度、纤维素酶浓度、酶解时间和离析酶浓度;甘露醇浓度和纤维素酶浓度对原生质体产量的增长表现相互促进模式,延长酶解时间情况下低纤维素酶浓度产出的原生质体较高纤维素酶浓度破碎情况少,峰值过后的产量下降慢。研究还发现取材幼苗苗龄、光照条件和取材叶位等因素对原生质体产量也有影响。综合以上结果确定了一套优化的参数组合:以黑暗培养条件下的10 d苗龄小麦幼苗第2片真叶为材料,酶解液中的纤维素酶浓度为0.5%、离析酶浓度为0.6%、甘露醇浓度为0.5 mol/L,酶解时间为6 h,使用此参数组合制备的原生质体形状均一、破碎情况轻,产量可达(7.28±2.18)×106个/g,有活性原生质体的比例可达(95.06±2.66)%。采用PEG-Ca~(2+)介导的方法将目标基因导入制备的原生质体,结果表明GFP基因的转化效率可达(61.31±5.74)%,小麦基因Ta ATG8h和异源植物拟南芥基因At PIP2;1的蛋白质产物均定位于正确的亚细胞结构处。 相似文献
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《分子植物育种》2021,19(19):6488-6494
本研究采用高盐低p H值法提取多花黄精叶绿体DNA (cpDNA),并通过L9(33)正交试验,以缓冲液中的Na Cl浓度、叶片用量及去核离心力为考察因素,优化多花黄精cpDNA提取工艺,并设计核基因组及叶绿体基因组特异性引物,验证cpDNA质量。结果表明,当NaCl浓度为1.50 mol/L,叶片用量为10 g,去核离心力为600×g时,以提取的cpDNA为模板,进行PCR扩增,能扩增出叶绿体基因片段且没有扩增出核基因片段,表明提取的cpDNA没有核基因组污染,质量好,产率高,能满足后续基因扩增等实验要求,该条件为本研究的最佳条件。该方法简便快速,对实验仪器要求不高,成本低,能够为黄精属植物cpDNA的提取提供参考。 相似文献
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雷蒙德氏棉叶绿体基因组Fosmid文库构建 总被引：1，自引：1，他引：0
采用高盐、低pH值法提取雷蒙德氏棉叶绿体DNA;通过物理剪切法获得随机断裂的DNA片段;剪切片段末端、补平修饰后与pCC1FOS载体连接;用噬菌体包装蛋白包装重组DNA,侵染大肠杆菌EPI300,构建了雷蒙德氏棉叶绿体基因组文库。对于叶绿体DNA剪切,以1 mL注射器中等速度吸打18次为最佳参数。叶绿体基因组Fosmid文库滴度为1×104 cfu·mL-1,插入片段大小平均为38 kb,最终筛选出39个克隆用于后续研究,覆盖叶绿体基因组9.2倍。以叶绿体特异标记筛选出能够覆盖雷蒙德氏棉叶绿体全基因组的6个克隆：F66,F46,F28,F8,F55和F3,为基因组结构和功能基因分析提供了良好的基础。 相似文献
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拟南芥DREB2A基因的克隆及植物荧光表达载体的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
以拟南芥幼苗总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增到DREB2A基因,并将其克隆到植物表达载体pCAM-BIA1304中CaMV 35 S启动子与poly(A)终止子之间。酶切鉴定及测序列结果都表明,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1304-DREB2A。另外,获得了携带DREB2A基因的根瘤农杆菌菌株,为以后转基因植物工作奠定了基础。 相似文献
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桑树1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(MnACO)启动子功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)作为关键酶,能够催化1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)形成乙烯。为探究桑树MnACO基因在桑树生长发育和抵御外界胁迫中的功能,本研究构建了p MnACO::GUS的植物表达载体并转化拟南芥。采用GUS组织染色法鉴定转基因拟南芥不同生长阶段及胁迫处理后的GUS活性。通过PCR克隆得到MnACO1和MnACO2启动子片段,它们分别为1518 bp和1429 bp,启动子区域有大量的TATA-box、CAAT-box和其他响应外界刺激的顺式作用元件。GUS活性分析显示MnACO启动子能驱动GUS在拟南芥中表达;MnACO1启动子能驱动GUS在拟南芥的根、叶片、花瓣、花药、花丝、柱头以及果荚中表达,且活性较MnACO2强;MnACO2启动子不能驱动GUS在果荚中无表达。转MnACO1和MnACO2植株经不同逆境处理后GUS表达活性不同,转MnACO1植株的GUS活性随处理延长时间而减弱,转MnACO2植株GUS活性随处理时间延长而增强。q RT-PCR检测2周苗龄的桑幼苗在经过胁迫处理后Ma ACO1和Ma ACO2的基因表达量,发现Ma ACO基因的表达模式与MnACO启动子GUS活性变化趋势一致。本研究结果表明,MnACO为诱导型启动子,MnACO1兼具组成型启动子特性,MnACO2兼具组织特异型启动子特性。MnACO1在转基因植株中对胁迫响应能力更强,预示着可将其用来调控改良桑树品种抗逆性靶基因;Ma ACO2可能与果实成熟有关,可将其启动子作为果实特异性启动子对桑椹品质进行合理改良。 相似文献
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芸薹属作物抗病性基因同源位点上的遗传多样性 总被引：4，自引：0，他引：4
用已知的拟南芥抗病性基因的8对引物对60个芸薹属作物和1份拟南芥品系进行了遗传多样性 分析, 除GPA1, PR1外, 其他6对引物的同源片段都被检测到。 其中与Atloxl 1 , BGL2, RPS2及PG11四个基因同源的片段检出率较高, 分别为62.5%, 94.7%, 87.5% 及100%。 用这些同源片段估计了甘蓝型油菜抗耐菌核病材料中油821、 中R783、 相似文献
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转梭梭HaPrxQ基因拟南芥植株的获得与检测 总被引：1，自引：1，他引：0
HaPrxQ是参与活性氧清除的重要基因。根据已发表的过氧还蛋白基因序列,设计特异引物,扩增到完整的HaPrxQ基因;构建植物表达载体pCAMBIA2300-HaPrxQ,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转化植株种子。对收获的T0代种子进行卡那霉素抗性筛选,并通过PCR对抗性苗进行检测。结果表明,构建的载体成功转化拟南芥并获得了9份转HaPrxQ基因苗。 相似文献
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广泛存在于生物体内的CYP450具有参与多种内源物质的新陈代谢和解除外源化学物质毒害作用的功能。本研究基于RNA-Seq数据,应用RT-PCR技术首次从樟叶越桔中克隆获得21个CYP450基因cDNA片段。应用生物信息学技术对21个樟叶越桔CYP450基因进行相似性分析、功能注释、家族分类以及聚类分析,除2个基因的家族分类不明确外,其余所有基因被分属于10个不同的CYP450家族中,分别为:CYP71、CYP72、CYP76、CYP81、CYP82、CYP86、CYP94、CYP97、CYP734和CYP735。推测有10个基因参与脂肪族、芳香族碳的羟基化,4个基因参与植物激素细胞分裂素的合成与降解,3个基因参与脂肪酸的羟基化,2个基因参与萜类化合物的合成。而KEGG分析结果显示2个基因家族未知的樟叶越桔CYP450基因可能参与了K00327途径。21个樟叶越桔CYP450基因能成功地与24个拟南芥CYP450基因聚类到一起。值得关注的是有2个樟叶越桔CYP450基因CL75.Contig12A(9)和Unigene225702A(14)被归类到拟南芥所特有的CYP82家族中,分别属于CYP82D和CYP82G亚家族,这为研究CYP82基因家族新物种来源提供了参考。本研究结果为认识樟叶越桔细胞色素CYP450基因和家族分类提供了信息,为樟叶越桔CYP450功能研究提供了参考依据。 相似文献
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拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因AtSTK的过量表达可以明显提高拟南芥的耐盐性。为进一步研究AtSTK基因表达的调控机制,以拟南芥基因组DNA为模板设计引物,扩增获得AtSTK基因的启动子序列,并构建到报告载体pAbAi,将重组报告载体质粒pAbAi-HYT利用BstbⅠ进行单酶切线性化,转化酵母菌株Y1H Gold,线性化的pAbAi-HYT整合到基因组中。然后,将纯化的拟南芥双链cDNA、pGADT7-Rec载体共转化含有报告载体pAbAi-HYT的酵母菌,将菌液涂布到含有100 ng/m L Ab A的SD/-Leu培养基上进行阳性克隆的酵母单杂交筛选。通过回复鉴定、序列测定,最终筛选获得了可能参与AtSTK基因表达调控的4个拟南芥基因。测序结果表明,酵母单杂交筛选获得的拟南芥基因AT3G32090含有WRKY转录因子保守结构域,为WRKY类转录因子的一员。因此,AtSTK基因的表达很可能接受MAPK信号传导途径中AT3G32090基因编码的WRKY类转录因子的调控,从而影响拟南芥植株的耐盐性。 相似文献
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Zhang Bin Liu Ji Zhang Chaojun Kong Depei Wang Peng Yang Zhao’en Li Fuguang Zhang Xueyan 《棉花学报》2018,30(3):205-214
[Objective] To provide theoretical basis for potassium efficient cotton breeding, this work aimed to evaluate the influence of low potassium on transgenic cotton seedlings over-expressing Arabidopsis thaliana’s AtCIPK 23, AtAKT 1 and AtCBL 1 genes, respectively. [Method] Hydroponics was used to explore the growth vigor, dry weight, potassium concentration and accumulation of transgenic cotton and CCRI 24 seedlings under low and optimum potassium conditions. Furthermore, the root morphology, potassium utilization index, potassium transport ability and the severity to damage were comprehensively analyzed to uncover the possible physiological mechanisms. [Result] Under the optimum conditions of potassium, the transgenic plants and control grew well and showed no significant difference. However, with low potassium stress, the dry weight of plants over-expressing AtAKT 1 gene was 1.66 times of CCRI 24. Its total root length, root surface area and volume were about 3 times than those of CCRI 24. The AtAKT 1 plants also displayed obvious growth advantage, higher potassium utilization index and transport ability, and the severity to damage was lower. Plants over-expressing AtCIPK 23 and AtCBL 1 genes, however, were almost the same as the CCRI 24. [Conclusion] This study revealed that the ability of cotton’s resistance to low potassium was significantly improved by over-expression of AtAKT 1 gene, an exogenous potassium ion channel protein gene from Arabidopsis thaliana. 相似文献
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瓣化型胡萝卜胞质雄性不育相关片段的分离及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
以128对引物组合对瓣化型胡萝卜胞质雄性不育系和保持系进行cDNA-AFLP分析，筛选与不育性相关的特异片段，对其中两个表达丰度较高的cDNA差异片段进行克隆测序。序列分析表明BY1949与拟南芥质子依赖性的类肽转运蛋白在核苷酸水平有87%的同源性，蛋白质水平有58%的同源性。BY2562与瓣化型胞质雄性不育（CMS）胡萝卜线粒体ATP8、ATP9、NAD6和cob-sp基因在核苷酸水平有99%的同源性，期望值为0.0；在蛋白质水平与CMS向日葵线粒体ORFB基因，COXIII 5'端未知蛋白YMF19以及CMS胡萝卜ATP-8，orfB-F1有97%的同源性；另外与胡萝卜orfB-CMS、orfB-F2、烟草orfB、油菜orf224、拟南芥线粒体orfB、萝卜orf158以及芥菜线粒体膜蛋白、甘蓝型油菜orf474也有90%以上的同源性。 相似文献