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1.
用由稻瘟病菌gp d基因启动子和终止子序列控制的、以粗糙脉孢菌的微管蛋白β-tubu lin(Bm 1)突变基因为选择标记的表达载体,转化稻瘟病菌0742野生型菌株,获得了两株具有苯菌灵抗性的菌株M 1和M 2。但Sou thern杂交表明,这两个菌株并不是由于质粒转化而获得苯菌灵抗性。对稻瘟病菌0742野生型及突变体M 1、M 2的β-tubu lin基因的序列比对分析表明,突变体M 1在内源β-tubu lin基因的第56、178、1704位置上发生了点突变,M 2在第56、899、1040、1389、1704位置上发生了点突变,导致M 1的352位氨基酸由苏氨酸变成了丙氨酸,M 2的107、154、270、352位氨基酸分别由苏氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸变为丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸。计算机分析显示M 1和M 2突变体β-tubu lin基因编码的蛋白质疏水性发生了微弱改变,结构域没有受到影响。该发现为开发新的稻瘟病菌遗传选择标记提供依据。 相似文献
2.
G细菌镉抗性决定子是一个编码4个蛋白的CzcCBAD操纵子,参照GenBank已登录Czc基因序列进行引物设计,利用PCR技术,从可在含350mg/LCdCl2的培养基上生长的抗镉菌株Ralstoniaeutropha质粒中,扩增出长度约为1200bp的革兰氏阴性细菌镉抗性系统中的抗性调节基因CzcR,然后将其亚克隆到pGEM-T-easy载体上,并转化至受体菌中,构建重组质粒,采用碱性裂解法提取质粒DNA后,经EcoRI酶切分析和核苷酸序列分析,其与GenBank中登录的CzcR基因序列相似性高达98%,显示其具有正确的CzcR基因核苷酸序列。镉抗性基因的获得将大大推动对微生物抗重金属机理的研究,并为进一步构建耐镉基因工程菌,高效净化重金属污染环境打下坚实的基础。 相似文献
3.
本研究以一株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌基因组DNA为模板,经PCR扩增得到的弹性蛋白基因,与GenBank中的序列对比发现同源性为99%。将弹性蛋白酶基因连入到表达载体pPIC3.5K中,经过酶切和测序鉴定证实弹性蛋白酶基因已插入到载体启动子下游,成功构建了质粒pPIC3.5K/PAE。将pPIC3.5K/PAE线性化,通过电转化将目的基因转入毕赤酵母KM71中,利用MD培养基筛选到近400个转化子,再经G418抗性的筛选,获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子并用PCR和弹性蛋白平板验证。经过甲醇诱导表达得到高表达的重组酵母菌株,酶活为1060U/mL是出发菌株的26倍。本研究成功克隆到铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,为实现活性弹性蛋白酶的高效表达奠定了基础。 相似文献
4.
将米曲霉植酸酶基因phyA克隆于植物表达载体pB1121的CaMV35S启动子（P35s）下游,构建了含有P35s—phyA-TNOS表达盒的重组质粒pBI-phyA,并用电脉冲法将其导人大肠杆菌中。通过三亲接合将pBI—phyA质粒由大肠杆菌导入根癌农杆菌LBA4404菌株,获得带有phvA基因的根癌农杆菌工程菌株LBA4404／pBI-phyA。用LBA4404／pBI—phyA转化木薯外植体652个,在含100mg／L卡那霉素和250mg／L氨苄青霉素的MS分化培养基上诱导分化芽,获得24株抗卡那霉素转化苗。以转化苗和未转化植株的总DNA为模板,用phyA基因的同源序列为引物,进行聚合酶链式反应（PCR）,结果表明9株转化苗的PCR结果为阳性,初步证明目的基因phvA已经转入木薯中。 相似文献
5.
毒死蜱降解菌株Bacillus latersprorus DSP的降解特性及其功能定位 总被引：10，自引：1，他引：10
从土壤中分离到一株能有效降解毒死蜱的细菌DSP，该分离株鉴定为侧芽孢杆菌（Bacillus latersprorus）。在纯培养条件下测定了分离株DSP对毒死蜱的降解性能。在接种量为菌浓度OD415=0．2，pH7．0、25℃条件下，测得1、10mg L^-1毒死蜱的降解符合一级动力学特征，其降解半衰期分别为1．48d、5．00d，100mg L^-1毒死蜱对DSP菌有明显的抑制作用；分离株DSP在不同pH及温度下对毒死蜱的降解作用为pH7．0〉pH5．0〉pH9．0，35℃〉25℃〉15℃。该菌株含有一个20kb左右的质粒，通过吖啶橙与升温法对质粒消除实验证实，随着质粒的丢失，菌株利用毒死蜱的能力也丧失，用热击法和CaCl2法将菌株质粒转人大肠杆菌JM109和质粒消除处理的DSP^-菌中，随着质粒的获得，这些转化子获得了降解毒死蜱的能力。研究结果表明，Bacillus latersprorus DSP降解毒死蜱的功能和质粒有关。 相似文献
6.
低毒病毒—板栗疫病菌组合是研究病毒—宿主相互作用的模式系统之一。通过构建含板栗疫病菌低毒病毒CHV1-EP713的全长cDNA和苯菌灵抗性基因的表达质粒pXB3F2,并用于转化野生型无毒株EP155,获得了以苯菌灵抗性为筛选标记、具有dsRNA病毒再生能力的低毒力遗传转化株LC,为深入研究病毒—真核宿主相互作用的分子机制提供了新的研究材料。 相似文献
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从放射性污染的土壤样品中分离出1株具有极端耐辐射的微生物BR501,该菌最适生长温度为30℃,不具有氨苄青霉素、氯霉素、四环素、卡那霉素和利福平等抗性。UV、γ辐射生长曲线的结果显示BR501菌株具有极强的辐射抗性。BR501菌株的16S rDNA序列与多株Deinococcus属菌株有很高的同源性,其中,与D.radiodurans菌株的16S rDNA相似性高达99%。结合BR501菌株的表型和Deinococcus属具有代表性的D.RadioduransR1菌株的特征,将该菌株归属为Deinococcus属,初步命名为Deinococcus sp.BR501。 相似文献
8.
瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch of watermelon,BFB)是近年来发生在西瓜、甜瓜等葫芦科(Cucurbitaceae)植物上的重要细菌病害,由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起.本研究以xjL12菌株为背景构建了转座子(Tn5)插入文库.通过注射接种哈密瓜(Cucumis melo var.saccharinus)子叶和烟草叶片进行突变体的筛选,得到l株致病性完全丧失并失去激发烟草(Nicotiana tabacum)过敏反应的突变体△xj48.对△xj48中转座子插入基因的克隆和测序表明,其突变基因为西瓜噬酸菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)中的保守基因hpaP.利用基因重组技术构建了hpaP基因的突变体,发现hpaP突变后影响了xjL12菌株的游动性、生物膜的形成能力及hrcV基因的表达.hpaP基因的互补菌株部分恢复其致病力.本研究证实了果斑病菌中的hpaP基因与该细菌的致病力相关,在侵染瓜类作物的过程中起着不可缺失的作用. 相似文献
9.
研究从土壤中分离出1株降解2,4-二氯酚能力较强的假单胞菌菌株“GT241-1”,并从中克隆出参与降解2,4-二氯酚的氯粘康酸环异构酶基因(dcpC),该基因编码的氯粘康酸环异构酶可将2,4-二氯-顺,顺-粘康酸转化为反式-2-氯-双烯内酯。采用的基因克隆策略是用Southern杂交对其邻近基因进行定位后构建基因组文库,再用斑点杂交从基因文库中筛选目的转化子。经序列测定得知dcpC基因编码区1110bp,且核苷酸和推测的编码氨基酸序列分析表明dcpC属氯粘康酸环异构酶基因家族,并与该基因家族的其他基因有一定差异。 相似文献
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柴燕文 《农业生物技术学报》2008,16(5)
利用分子克隆技术,将GFP基因片段插入到pBI121-Lyz多克隆区,构建了重组表达载体pBI121-Lyz-GFP。经SmaI与BamHI双酶切和PCR验证重组质粒,均能得到约750bp的目的片段,通过进一步测序证明：GFP基因已成功连接到pBI121-Lyz中,且重组质粒连接方向正确。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌菌株LBA4404,用叶盘法转化和田苜蓿,筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和荧光显微镜检测证明重组基因已成功转化到和田苜蓿愈伤组织中。 相似文献
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12.
构建植物病原菌突变体库是进行新基因发掘和功能基因组学研究的有效途径之一。为了快速准确地确定Tn5的插入位点和相应的功能基因,本研究采用TAIL-PCR和Tn5转座子质粒拯救两种技术对本实验室在筛选Tn5转座子插入水稻条斑病菌的突变体库过程中获得的8个在水稻上毒性减弱的突变体进行了鉴别。结果显示,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救相互结合使用,可有效鉴别Tn5的插入位点和相应的功能基因。TAIL-PCR明确的5株突变体是Tn5分别插入在gspF、cAMP-regulatory protein、Integral membrane protease subunit、S-adenosylmethionine decarboxylase proenzyme和gpsJ 基因上从而导致水稻条斑病菌的毒性发生了改变;Tn5质粒拯救法明确的3株突变体是Tn5分别插入在pathogencity protein、conserved hypothetical protein和flagellum-specific ATP synthase 基因上。同源分析发现,8株突变体Tn5插入的基因与已基因组测序的BLS256菌株中的基因同源性达100%。这表明,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救技术可有效应用于植物病原菌Tn5突变体库的鉴别和目标基因的分离。 相似文献
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家蚕胞质肌动蛋白基因启动子的克隆及piggyBac转座子表达载体的构建 总被引：4，自引：0，他引：4
摘要: 利用PCR方法从家蚕（Bombyx mori）总DNA中克隆到细胞质肌动蛋白基因（cytoplasmic actin）启动子片段，序列分析表明，该片段中含有典型的组成型表达的细胞质肌动蛋白基因A3（BmA3）调控序列：SRE元件（serum response element）和ActE1元件(active element 1)。该序列的核苷酸序列与来自欧洲的一个家蚕品种的序列同源性为94%。通过多次重组，将A3启动子片段(不含信号肽序列)与转座子 piggyBac的转座酶编码区融合构建成辅助质粒；将其(含信号肽序列和部分编码区)与报告基因多管水母绿色荧光蛋白基因gfp融合，插入到人工合成的转座子piggyBac两反向重复末端序列之间，进而构建成基于转座子piggyBac的转基因载体。研究中构建的转座子转基因载体仅6.4 kb，并在两反向重复末端序列之间设计了1个多克隆位点区，便于目的基因的插入。 相似文献
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利用转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５上的抗性基因,通过“鸟枪法”克隆到用这种转座子诱变甘蓝黑腐病黄单胞菌所获得的三个胞外多糖突变体菌株Ｔ１０６、Ｔ１１３和Ｔ１１７中的转座子及其相邻序列的ＤＮＡ片段,并利用含有这些片段的重组质粒,通过标记置换构建了突变体。通过检测标记置换突变体的胞外多糖产量及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,证实了胞外多糖突变株Ｔ１０６、Ｔ１１３和Ｔ１１７不仅确系转座子插入所致,而且转座子插入的位点分布在染色体的不同区域。从而证实了我们所报道的诱变体系是可行的 相似文献
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转座子诱变生防枯草芽胞杆菌B-916及抗真菌活性相关基因的克隆 总被引：2，自引：0，他引：2
摘要：生防枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)B-916对水稻纹枯病有很好的防治效果。研究报道了采用转座子诱变技术从8 500个突变株中筛选到3株抗水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani )下降的突变株。PCR验证了转座子插入到了突变株基因组DNA中。虽然突变株相对B-916的生长速度,生物量和最终活菌数没有显著差异;但培养液对水稻纹枯病菌毒力和溶血性能显著下降。HPLC分析表明,B-916分泌的脂肽类抗生素与伊枯草素保留时间不同;突变株M-1、M-2和M-3相对B-916产生脂肽类抗生素发生显著变化。反向PCR克隆转座插入位点周边序列及测序结果表明,转座突变的基因与编码脂肽类化合物合成和调控相关的malonyl coenzyme A transacylase、lipopeptide synthetase B和sensor histidine kinase蛋白基因具有高度同源性。通过基因步行法实验已克隆到插入位点全长基因,分别命名为BacD,BacD和Degs,递交到GenBank,接受序列号为FJ192262和FJ194461。进一步进行了生物信息学分析发现,B-916 编码lipopeptide synthetase B基因与目前已报道的相应基因存在低同源性区域。 相似文献
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Göran Bengtsson 《Soil biology & biochemistry》2004,36(6):999-1008
We examined the stability of plasmid RP4 and its expression of antibiotic-resistance genes in suspended and sorbed Pseudomonas putida in aquifer microcosms. Test tubes containing different proportions of sterilized aquifer soil and groundwater were inoculated with bacteria and incubated for up to 26 d. Serial dilutions were made to agar plates with or without antibiotics, to quantify the functional stability of the plasmid. The structural integrity of RP4 was examined by plasmid extraction, digestion with restriction enzymes, and agarose gel electrophoresis. The plasmid-borne resistance gene expression disappeared in 80-90% of the cells during day 1 of incubation in aquifer soil and then remained at that frequency throughout the experiment. The RP4 plasmid was present in cells without antibiotic-resistance gene expression, indicating that the observed loss of plasmid-encoded activity was most likely due to a reduction in expression of the resistance genes. The increased growth rate in groundwater amended with glucose and phosphate had no significant influence on plasmid loss or antibiotic-resistance expression, suggesting that plasmid loss and antibiotic-resistance expression were independent of the growth rate. Most of the reduction of resistance gene expression was associated with the presence of soil particles, and 70% of the resistance expression was retained in bacteria incubated for 1 d in groundwater alone. Bacteria sorbed to the soil particles had a lower frequency of expression of resistance genes than suspended bacteria, but the difference was not caused by sorbed inorganic or organic chemicals. Resistance gene expression was partly recovered in suspended bacteria after in vitro exposure to the antibiotics and after first isolating on agar without antibiotics and then replica plating to agar containing the antibiotics. 相似文献
17.
《Soil biology & biochemistry》2001,33(12-13):1749-1758
Pseudomonas sp. BG33R was isolated from peach orchard soil suppressive to the phytoparasitic ring nematode, Mesocriconema xenoplax. Tn5 transposon mutagenesis was utilized to generate five BG33R mutants 246, 1122, 1233, 1397, and 1917, which lacked ovicidal activity and also exhibited altered fluorescent siderophore and protease production. Southern blot analysis revealed that each of the five mutants contained a single unique Tn5 insertion. Mobilization of selected BG33R genomic cosmid clones into mutants 246 and 1917 restored egg-kill activity and restored normal protease and siderophore production. Furthermore, a genomic cosmid clone hybridizing to the Tn5 insertion site in 1122 also complemented mutant 1917. Site-directed mutagenesis of BG33R using the cloned Tn5 insertion site from mutant 1397 resulted in the loss of ovicidal activity and restoration of the hyperfluorescence phenotype. Sequence analysis was performed on the genetic regions flanking the Tn5 insertion site in all five egg-kill-negative mutants. Open reading frame analysis and amino acid comparative database searches of the Tn5 insertion sites in the five mutants revealed a high degree of homology to the vgrG gene, the two-component sensor kinase protein, rtpA (gacS analog), a UDP-glucose 4-epimerase gene, a siderophore receptor protein, and the 50S ribosomal protein, L21. The involvement of these genes in the production of the egg-kill factor is discussed. 相似文献
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青枯雷尔氏菌Tn5转座子无致病力突变株构建及其生物学特性 总被引：2，自引：0，他引：2
青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是植物细菌性青枯病的病原菌,为研制植物疫苗菌剂提供遗传稳定且突变位点明确的青枯雷尔氏菌无致病力菌株,本研究利用EZ-Tn5转座子随机插入青枯雷尔氏菌(Rs91)构建青枯雷尔氏菌无致病力突变体库,通过电击转化,筛选获得13株具有无致病力菌株形态的突变株。研究了其中5株突变株的插入位点和生物学特性,结果表明,其插入位点分别位于phcA和pchS基因,其生长速率和相对胞外多糖含量显著低于Rs91,而最适pH值和温度未改变。其发酵液经分光光度计扫描,结果显示,突变株在同一波长下的光吸收值均大于Rs91,经聚类分析,显示它们与Rs91可聚为不同的3类,即Rs91为第Ⅰ类,phcA基因突变株为第Ⅱ类,phcS基因突变株为第Ⅲ类。经番茄(Lycopersicon esculentum)盆栽苗致病力检测,15d后均未发病,确定为无致病力青枯雷尔氏菌。本研究为研制防治青枯病的植物疫苗菌剂提供了基础资料。 相似文献
19.
Murata M Haruta M Murai N Tanikawa N Nishimura M Homma S Itoh Y 《Journal of agricultural and food chemistry》2000,48(11):5243-5248
Transgenic apple shoots were prepared from leaf disks by using Agrobacterium tumefaciens carrying the kanamycin (KM) resistance gene and antisense polyphenol oxidase (PPO) DNA. Four transgenic apple lines that grew on the medium containing 50 microgram/mL KM were obtained. They contained the KM resistance gene and grew stably on the medium for >3 years. Two transgenic shoot lines containing antisense PPO DNA in which PPO activity was repressed showed a lower browning potential than a control shoot. 相似文献
20.
李汉霞;尹若贺;陆芽春;张俊红 《农业生物技术学报》2006,14(4):546-550
以结球甘蓝（Brassica oleracea var. capitata ）下胚轴为外植体，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciecin）介导法将苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）杀虫蛋白基因CryIA(c)导入结球甘蓝栽培品种中，共获得56株卡那霉素抗性植株。分别以CryIA(c)和NPTⅡ基因引物进行PCR扩增，结果43株均扩增出了预期的目的带。以CryIA(c)基因为探针，进行Southern blot分析，证明外源基因已经整合到甘蓝基因组中，且多数转基因植株只含有单拷贝的外源基因。离体叶片抗虫实验表明，转基因植株幼虫校正死亡率为40%，平均单虫重达到极显著水平，叶片损害程度差异明显，转基因植株抗性较对照显著提高。通过卡那霉素涂抹叶片和PCR扩增两种方法鉴定，表明外源基因在转基因甘蓝自交后代呈孟德尔单基因遗传。 相似文献