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利用染色体步移(Genome walking)技术,克隆柠条锦鸡儿CkNCED1基因上游启动子序列。经顺式元件预测分析,该序列除基本的启动元件之外,还含有2个脱落酸诱导响应元件ABRE、此外还含有多个逆境相关的元件。将CkNCED1基因启动子区连接到pGWB533植物表达载体上,构建Promoter::GUS载体,GUS组织化学染色结果表明,CkNCED1基因在植物的叶、根、茎、花和角果的维管组织中均有表达,且在叶片中表达强度最高。以上研究确定了柠条锦鸡儿CkNCED1基因的表达部位和强度。进一步说明CkNCED1基因在ABA合成调控中发挥重要作用,为深入研究基因功能奠定基础。 相似文献
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新牧1号苜蓿两种抗逆相关启动子的功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
前期已成功克隆了新牧1号苜蓿MvP5CS与MvNHX1基因和二者的启动子序列。在此基础上,本试验分别构建了含有Mvp5cs和Mvnhx1启动子的调控GUS报告基因的植物表达载体,并通过农杆菌介导法得到了含有Mvnhx1与Mvp5cs启动子的转基因烟草植株。PCR检测证明了两种启动子已稳定的整合到烟草基因组中;GUS组织染色证明两种启动子均具有启动基因表达的功能。通过测量GUS活性来探究两种不同的诱导型启动子在4种非生物胁迫下(干旱、盐、脱落酸、赤霉素)的表达活性。结果表明,1)Mvnhx1与Mvp5cs启动子均响应盐、脱落酸、赤霉素、干旱胁迫,与CaMV35S启动子相比,差异显著。2)Mvnhx1启动子在盐胁迫、脱落酸胁迫下所起诱导作用要优于Mvp5cs启动子。在48 h 100 mmol/L、150 mmol/L NaCl胁迫处理时,Mvnhx1启动子GUS活性分别是Mvp5cs启动子的2.03和3.23倍,差异显著。在25 μmol/L、 50 μmol/L ABA处理下,Mvnhx1启动子的活性整体高于另两种启动子,差异显著。3)Mvp5cs启动子在干旱胁迫、赤霉素胁迫所起诱导作用优于Mvnhx1启动子。干旱胁迫时,Mvp5cs启动子的GUS活性在36 h是同时间Mvnhx1启动子的2.22倍。70 μmol/L GA处理时,Mvp5cs启动子在36 h达到最大值,是同时间段Mvnhx1启动子的1.79倍。 相似文献
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为了进一步探明盐生草HgNHX1基因启动子的功能,从盐生草基因组中克隆了HgNHX1基因上游 5'侧翼调控区1523 bp的序列,即HgNHX1基因启动子(pHgNHX1)序列,并利用PlantCARE、PLACE等在线软件对HgNHX1基因5' 端上游序列进行预测和分析,发现该启动子中除具有TATA-box、CAAT-box等核心启动子元件外,还含有多个与盐、干旱、缺水、冷、伤害等逆境胁迫诱导有关的作用元件;同时具有生长素、脱落酸、赤霉素及乙烯等植物激素诱导响应的功能元件,表明分离得到的DNA片段具有典型启动子的一般特征。构建pBI-HgNHX1启动子植物表达载体并转化拟南芥和烟草,利用组织染色法鉴定转基因烟草和拟南芥的 β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)表达模式,发现在转基因拟南芥的各个器官均有GUS 酶的活性,说明pHgNHX1具有一定的组成型启动子活性。 相似文献
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维生素E是一种人体必需,却不能自主合成的脂溶性维生素。尿黑酸植基转移酶(HPT)是维生素E生物合成途径的关键限速酶,直接影响植物体内维生素E的总量。本实验利用同源克隆的方法,根据截形苜蓿的序列从紫花苜蓿中克隆得到HPT基因的完整开放阅读框(ORF)。NCBI Blast分析结果表明,该基因编码412个氨基酸,属于异戊烯转移酶UbiA超家族。多序列比对结果表明,该序列与其他物种的HPT蛋白序列相似度高达80%,将其命名为MsHPT。进化树分析结果表明,MsHPT与截型苜蓿MtHPT亲缘关系最近,蛋白序列相似度为96.84%。通过染色体步移技术得到该基因的启动子序列,分析结果显示,该基因的启动子区域含有胁迫响应元件、激素响应元件(脱落酸、赤霉素和乙烯)以及大量的光响应元件。实时荧光定量PCR检测结果表明,MsHPT基因在紫花苜蓿各组织中均有表达,叶片中的表达量最高,根次之。经低温、NaCl、PEG、GA3和ABA诱导后该基因表达均上调,表明其可能参与了植物的抗逆性调控。扩增MsHPT基因的开放阅读框,对其进行双酶切后转入双元表达载体pBI121中,通过农杆菌介导的方式将该基因转入拟南芥。通过PCR鉴定,得到7株阳性苗。本研究为进一步探索MsHPT在紫花苜蓿维生素E的合成以及紫花苜蓿抗逆调控中的作用奠定了基础。 相似文献
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为了探讨家蚕丝素重链基因的调控机制,应用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)为基因转移载体,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,研究了丝素重链基因启动子克隆片段在家蚕丝腺的不同部位,以及脂肪体细胞和Sf9培养细胞中的表达渗漏。结果发现,丝素重链启动子克隆片段在家蚕中部丝腺存在表达渗漏,并且在中部丝腺前部的表达活性要强于中部丝腺的中部和后部;克隆片段在脂肪体组织存在表达渗漏,通过荧光解剖显微镜可以在体表观察到绿色荧光;克隆片段在Sf9培养细胞中也存在表达渗漏。上述结果说明目前已知的有关家蚕丝素重链基因的调控元件仍不充分,家蚕基因组中可能还有其他调控丝素重链基因表达组织和时相的特异性元件存在。 相似文献
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本研究旨在确定徐淮山羊c-Myc基因启动子区域,找出该基因启动子的核心调控区,初步探讨c-Myc基因的表达调控机制。根据UCSC基因组数据库已公布的绵羊c-Myc基因的启动子序列,设计特异性PCR引物扩增c-Myc基因的一系列启动子缺失片段,定向克隆至pEGFP-N1和PGL3-c-Myc,分别转染gFF、COS7及P19细胞,并进行TSA和NFAT1诱导,同时对-402~-249bp区域的转录因子SP1结合位点进行定点突变,最后进行双荧光报告基因活性检测。结果表明,徐淮山羊c-Myc基因5′侧翼区-1 334~+1bp区域的启动子活性最强,-402~+1bp区域为c-Myc基因启动子基本活性区域。进一步研究发现,-1 334~-971bp、-587~-147bp区域存在正调控元件,-1 976~-1 334bp、-971~-587bp区域存在负调控元件。TSA和NFAT1均能增强cMyc启动子的活性,SP1结合位点定点突变后,启动子活性降低。本试验通过构建包含c-Myc基因启动子不同片段的重组报告基因载体并比较其转录活性,确定了c-Myc基因启动子的核心区域,发现转录因子SP1是c-Myc基因启动子核心区域的调控元件,为进一步研究c-Myc基因的表达调控机制奠定了基础。 相似文献
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【目的】探究秦川牛多形性腺瘤基因1(pleomorphic adenoma gene 1,PLAG1)的组织表达规律,并克隆其启动子区序列,预测分析其关键转录因子结合位点,为探究其转录调控机制提供理论参考。【方法】采集3头20月龄秦川牛成年公牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪、背最长肌、瘤胃组织,用实时荧光定量PCR方法检测PLAG1基因在不同组织中的相对表达量,同时克隆PLAG1基因上游启动子区序列,利用生物信息学软件预测PLAG1基因转录起始位点及启动子核心区域,分析、筛选核心启动子区域的关键转录因子结合位点。【结果】PLAG1基因在秦川牛各组织中均有表达,且在背最长肌中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。PLAG1基因启动子序列全长1 861 bp,生物信息学预测分析发现PLAG1基因核心启动子区位于-297―+42 bp,存在高度保守的Krüppel样因子5(KLF5)、cAMP反应元件结合蛋白1(CREB1)和早期生长反应因子1(EGR1)转录因子结合位点,且CpG岛位于PLAG1基因核心启动子区域内。【结论】PLAG1基因在肌肉组织中高表达,其核心启动子区... 相似文献
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农杆菌介导犁苞滨藜NHX基因转化苜蓿的影响因素 总被引：4，自引：1，他引：3
以新牧1号杂花苜蓿(Medicago varia Martin.cv.Xinmu No.1)和新疆大叶苜蓿(Medicago sativa L.cv.Xinjiang Daye)无菌苗叶片和子叶为材料,通过根癌农杆菌EHA105介导转化犁苞滨藜NHX耐盐基因,提高植株耐盐性。本文对农杆菌转化条件进行研究,结果表明:以预培养3d的子叶为转化受体,菌液浓度OD600为0.4～0.5时,浸染10～15min,然后转入附加20～30mg/L乙酰丁香酮的共培养基,培养4d,可以获得较高的转化效率;对抗性芽的PCR检测初步证明,外源基因整合到苜蓿的基因组中。 相似文献
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以山定子和Y系早花山定子为试材,分析苹果不同花发育相关基因MbFT1、MbFD、MbMADS12、MbAP1、MbSOC1在山定子和早花山定子的芽及韧皮部中的表达模式,以期为探究早花山定子早花机制提供理论依据。研究结果显示,MbAP1基因在山定子和早花山定子中的表达模式及表达量可能是影响早花山定子早花发育的一个重要因素,分别以山定子和早花山定子的基因组DNA为模板,扩增MbAP1基因的启动子序列。研究结果显示,山定子和早花山定子MbAP1基因的启动子序列存在碱基差异位点,其中在-388bp碱基处碱基由C 变为G,作用元件由山定子的生长素响应元件(TGA-element)变为早花山定子的水杨酸响应元件(TCA-element),推测MbAP1基因在山定子和早花山定子中表达模式的不同可能与两者启动子碱基差异有关。 相似文献
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试验旨在利用生物信息学方法对秦川牛肉用新品系(以下简称“秦川肉牛”)AdipoR1、AdipoR2基因的CDS区进行克隆及分析,并探究其在秦川肉牛不同组织及肌细胞诱导分化不同时间的表达情况。以秦川肉牛为研究对象,经PCR扩增得到AdipoR1、AdipoR2基因CDS区序列,运用生物信息学软件对其功能结构进行预测,同时采用实时荧光定量PCR术获得AdipoR1、AdipoR2基因在秦川肉牛15个组织和诱导分化后不同时间的表达量,再进行差异分析。结果显示,秦川肉牛AdipoR1基因编码序列全长为1128 bp,编码375个氨基酸,蛋白分子质量为42446.41 u,理论等电点为6.70,AdipoR1蛋白二级结构主要由α-螺旋构成,二、三级结构预测结果一致,属于亲水性蛋白,没有信号肽位点;AdipoR2基因编码序列全长1161 bp,编码386个氨基酸,蛋白分子质量为43707.70 u,理论等电点为6.27。亚细胞定位结果表明,AdipoR1蛋白有60.9%的可能定位在细胞膜,AdipoR2蛋白有73.9%的可能定位在细胞膜。不同物种氨基酸系统进化树结果显示,秦川肉牛AdipoR1、AdipoR2基因编码的氨基酸序列分别与瘤牛和野牦牛的亲缘性最近。实时荧光定量PCR结果显示,AdipoR1、AdipoR2基因在秦川肉牛心脏、肝脏、肌肉等15个组织中均有表达,且在肌肉组织中的表达量最高,极显著高于其他组织(P<0.01),在肌细胞诱导分化时序上也有明显差异。本试验揭示了AdipoR1和AdipoR2基因在秦川肉牛不同组织和肌细胞诱导分化后不同时间上的表达差异,以期为进一步探究AdipoR1、AdipoR2基因的生物学功能与调控机理奠定基础。 相似文献
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利用绿色荧光蛋白报告基因筛选植物乳杆菌强启动子 《畜牧与饲料科学》2021,42(5):6-11
[目的] 结合已知植物乳杆菌启动子和绿色荧光蛋白报告基因,筛选能够进行稳定强表达的启动子,为构建植物乳杆菌高效特异表达载体提供基因元件。[方法] 分别合成已知植物乳杆菌启动子P11、Pefp、Ptuf33和Ptuf34及其下游绿色荧光蛋白报告基因,并使用上述合成序列分别替代pMG36e乳酸菌表达载体原有多克隆位点及其上游启动子部分,形成启动子筛选载体。利用电转方法将成功构建的启动子筛选载体转化至植物乳杆菌,通过检测重组子绿色荧光信号强弱对比分析启动子强弱特性。[结果] 4个启动子中转录延伸因子TU基因启动子Ptuf33和Ptuf34在受体植物乳杆菌中表达目的基因水平显著（P<0.05）高于其他启动子。[结论] 结合该研究结果及相关报道可知,启动子Ptuf33和Ptuf34在植物乳杆菌中普遍高表达,可以为后续高表达植物乳杆菌载体构建提供元件。 相似文献
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对金黄地鼠Kcnq1基因进行分子克隆与鉴定以及在多种器官组织的表达差异进行分析,旨在研究Kcnq1基因在地鼠各组织器官中的功能。提取金黄地鼠心脏组织总RNA,根据大鼠Kcnq1的保守序列区域设计引物TK1,用RT-PCR的方法从金黄地鼠心脏组织中扩增出Kcnq1cDNA片段,并且以心脏cDNA片段为模板,将纯化后的cDNA在T4连接酶的作用下与pMD18-T载体特异性连接,转化感受态大肠杆菌DH5α中,筛选重组子并酶切鉴定,将鉴定后的重组子进行DNA测序。提取心、肝、脾、肺、肾各组织总RNA,并反转录,将各组织cDNA做荧光定量检测,检测各组织表达量的差异。结果显示克隆出金黄地鼠Kcnq1基因477bp的部分片段长度,推测出编码的159个氨基酸。与大鼠等物种Kcnq1基因比对,核苷酸和氨基酸序列均具有较高的同源性。荧光定量结果显示,Kcnq1在金黄地鼠心脏中表达量最高,在肺脏和肾脏中均有较高表达,在脾脏中低度表达,在肾脏中基本不表达。该研究结果为深入研究金黄地鼠Kcnq1基因功能奠定了基础。 相似文献
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鸡传染性贫血病毒VP1和VP2基因共表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中收录的鸡传染性贫血病毒(CIAV)基因组序列,设计了扩增CIAV VP1和VP2基因的特异性引物,运用PCR技术从发病鸡肝组织DNA中扩增得到VP1、VP2基因,并将其克隆至pMD18-T载体.核苷酸测序结果显示,其序列与发表的序列同源性达到99.8%.将VP2基因克隆到pMD18-T载体,并对Vp3基因起始密码子进行定点突变,得到突变基因mVP2.将mVP2、VP1先后克隆至pIRES载体,并转化大肠埃希菌JM109,提取质粒通过酶切鉴定显示,成功获得了共表达质粒pIRES-VP1/mVP2. 相似文献
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为了建立猪源大肠杆菌对氟苯尼考、β-内酰胺类与粘杆菌素耐药基因的多重PCR检测方法,本研究以氟苯尼考耐药基因floR、β-内酰胺耐药基因CTX-M、粘杆菌素耐药基因mcr-1作为目的基因,设计3对特异性引物,通过对多重PCR反应体系及条件的优化,成功建立了多重PCR检测方法。该方法的灵敏度为1.46×10^5CFU/m L,具有高度特异性、敏感性和可重复性。本方法的建立为大肠杆菌中常见耐药基因的快速检测及分子流行病学调查提供了新的手段。 相似文献