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有效去除农杆菌和籼稻转化系统优化 总被引：4，自引：0，他引：4
为了提高根农杆菌籼稻转化效率，将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因sck和潮霉素磷酸转移酶基因hpt：分别置于紧密相连的2个T-DNA上，构建载体pCDMARUSCK-HPT，电激法将表达载体转化农杆菌LBA4404．获得工程菌。比较了提门叮和国产噻孢霉素对工程菌LBA4404．的抑制效果，试验得出提门叮在500mg／L以内比噻孢霉素能更有效地去除水稻细胞中的农杆菌，而且低浓度条件下(250mg／L)就能有效地抑制工程菌LBA4404，并且有利于水稻转化细胞成功地再生植株。确立了工程菌LBA4404菌液浓度OD值0．8，浸染时间5min为明恢86合适的转化参数。在此基础上，采用优化的农杆菌介导法转化杂交籼稻优良恢复系明恢86，获得转基因植株127个克隆，转化效率4．5％。 相似文献
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转基因烟草表达高山被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因的研究 总被引：3，自引：0，他引：3
将高山被孢霉ATCCl6266△^6-脂肪酸脱氢酶(D6D)基因亚克隆到植物表达载体pBIl21中，构建了CaMV35S启动子驱动的植物表达载体pBMACL6。经根癌农杆菌LBA4404的介导，采用叶盘法转化烟草Xanthi，得到一批转基因烟草植株。转基因植株的PCR和Southern blot分析表明，D6D基因已经整合到烟草基因组中。脂肪酸GC分析表明，与未转基因的烟草苗对照相比，转基因植株有D6D基因目标产物γ-亚麻酸的产生，说明高山被孢霉的D6D基因在烟草中得到了表达。 相似文献
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玉米特异启动子驱动下结核Hsp65与Esat-6融合基因表达载体的构建及鉴定 总被引：2，自引：2，他引：0
利用转基因玉米研制新型结核口服疫苗.构建植物双元表达质粒pCAMBIA1300GHLE,并转化农杆菌LBA4404.以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65-Esat6基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上;将globulin1-HLE联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中;电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中.成功构建了pC1300GHLE质粒,酶切鉴定得到3.3 kb和8.6Kb2条带,测序分析表明克隆的H8p65和Esat6序列与NCBI上公布序列一致;成功转化到农杆菌中,酶切从农杆菌中所提的质粒,条带大小与预期结果相符合.成功构建和转化了pCl300GHLE表达载体,为成功研制利用转基因植物生产抗结核口服疫苗奠定了基础. 相似文献
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构建包含结核杆菌Ag85B基因的植物表达载体,并转化农杆菌LBA4404。以pcDNA3-Ag85B为模板,通过常规PCR克隆出Ag85B基因,定向克隆至含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上,然后将globulin-1-Ag85B的融合片段酶切下来,并连接到经过加工修饰的含有抗除草剂基因bar的双元表达载体pCAMBIA1300上,将重组质粒转化至农杆菌LBA4404中。重组质粒双酶切可见0.8bp和10kb的两条特异性条带,与预期大小相一致。重组质粒测序表明克隆的Ag85B基因序列与Genbank上相一致,酶切从农杆菌中所抽提的质粒,片段大小与预期相一致。成功构建与转化了携带结核Ag85B基因的植物双元表达载体,为利用植物反应器生产口服结核疫苗奠定基础。 相似文献
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利用农杆菌介导的花蕾浸泡转化法将拟南芥生长素反应因子8(Auxin Response Factor 8,AtARF8)基因导入油菜花序后获得转化种子.在转化种子的抗性筛选中会产生种子内生菌污染现象.通过对内生菌的细胞学观察及PCR分子鉴定,确定种子内生菌来白转染的农杆菌LBA 4404;选择抗生素头孢曲松钠和硫酸庆大霉素进行抑菌H试验,50mg/L头孢曲松钠可似抑制农杆菌生长,同时对植株真叶数量、根系数量、株高、叶片颜色等影响较小.因此,头孢曲松钠可作为该转基因材料抗菌素抗性筛选中种子内生菌的抑制剂. 相似文献
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转外源法呢基焦磷酸合酶基因烟草抗赤星病研究 总被引：4，自引：0，他引：4
将已克隆的薄荷（Mentha spicata L.）法呢基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase, fps）的cDNA插入载体,构建CaMV35S启动子驱动下的植物表达载体pBinARfps。用捕获该质粒的根癌农杆菌菌株LBA4404与烟草叶片外植体共培养,并在附加30 mg/L Kan的MS＋0.1 mg/L IAA＋1.5 mg/L BA培养基上诱导植株分化,再生芽在附加30 mg/L Kan的MS培养基上生根,再生植株。Kan阳性植株经PCR-Southern检测筛选,得到5株PCR阳性植株（K-4,K-6,K-17,K-19,K-35）,证明外源fps基因在烟草基因组中的整合;Northern blot检测证明外源fps基因在转录水平进行了表达;离体叶片接种实验表明,转基因植株（T1代）对赤星病抗性明显提高。这表明fps基因在植物抗病基因工程中具有潜在应用价值。 相似文献
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红掌漆酶基因Lac的表达载体构建与剑麻转化 总被引：1，自引：0，他引：1
用RT-PCR从红掌品种亚利桑那的cDNA中扩增出漆酶基因Lac并得到的基因的全长.将Lac片段克隆到pMD18-T载体,然后将此基因插入pBI121的CaMV35S启动子后取代原载体中的GUS基因构成表达载体pBI121-Lac.通过冻融法将表达载体导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404,并转化剑麻获得转基因植株.对转化植株进行的基因组PCR分析结果表明,Lac基因已成功的整合到剑麻的基因组中.转漆酶基因植株的获得为剑麻抗性的提高提供了可能性,并且为以后研究漆酶的具体功能提供了方便. 相似文献
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苹果叶盘法基因转化中抗生素种类和浓度的筛选 总被引：2，自引：0，他引：2
以苹果品种嘠拉试管苗为试材，研究了卡那霉素（Km）、潮霉素（Hm）对继代苗生长和离体叶片再生的影响，以确定叶盘法基因转化的选择压和转化体的筛选浓度以确定苹果叶盘法基因转化中的选择压和抗性芽的筛选浓度；同时研究了不同浓度的头孢霉素（Cef）和羧苄青霉素（Carb）对苹果离体叶片再生的影响及对农杆菌EHA105和LBA4404的抑菌效果，以确定苹果叶盘法基因转化中合适的抑菌抗生素种类和浓度；以确定侵菌共培养后合适的抑菌抗生素种类和浓度。。结果证明表明：Km卡那霉素10mg/L、Hm4.0 mg/L完全抑制了叶片不定芽的分化，可作为苹果叶盘法转化时抗性芽的选择压； 在Km 50mg/L、Hm5.0 mg/L达到继代苗的半致死浓度，可作为基因转化后抗性芽苗的筛选浓度，10mg/L时完全抑制供试叶片不定芽的分化。；由于抗性芽再生的选择压与抗性苗筛选浓度相差较小，Hm相对于Km更适合作为苹果基因转化的选择标记；培养基中附加潮霉素的浓度为5mg/l继代苗不再分化生长，作为基因转化后抗性芽的筛选浓度，2.0mg/L时完全抑制供试叶片不定芽的再生，作为基因转化后抗性芽的筛选浓度。头孢青霉素在Cef 300mg/L时就能完全抑制农杆菌生长，对叶片不定芽的再生影响不大；而附加Carb羧苄青霉素则需400mg/L以上时才能抑制农杆菌LBA4404的生长，同时严重抑制了叶片再生。因此，宜选用Cef作为苹果基因转化的抑菌抗生素。 相似文献
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为了筛选适合万寿菊不定芽诱导的最佳外植体及激素浓度组合,并探讨该组织部位对卡那霉素、潮霉素的抗性临界点以及头孢霉素和利福平对LBA4404的抑菌性效果,构建万寿菊遗传转化体系。本研究以三种激素为组合,以万寿菊雄性不育两用系2-2的子叶、下胚轴、叶片为材料筛选出适合万寿菊的再生体系的激素配比及最佳的组织部位;以万寿菊子叶为材料筛选其对卡那霉素、利福平、头孢霉素、潮霉素四种抗生素抗性临界点;筛选利福平、头孢霉素对农杆菌LBA4404的抑菌浓度。结果表明：1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA+30 g蔗糖的MS培养基可以作为万寿菊子叶的最佳诱导激素浓度组合,MS5和MS9可以在万寿菊叶片中诱导出不定芽,但诱导率极低,下胚轴在48个激素组合无不定芽的产生;利福平和头孢霉素两种抗生素浓度在200 mg/L时能对LBA4404农杆菌的生长起到有效的抑制,并且在该浓度下对万寿菊子叶不定芽的产生起到一定的促进作用;子叶对于潮霉素、卡那霉素的抗性浓度分别为30、100 mg/L。利用建立的万寿菊再生体系及抗生素浓度体系可以为农杆菌介导万寿菊遗传转化提供理论基础。 相似文献
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根癌农杆菌介导籼稻遗传转化影响因素研究 总被引：4，自引：0，他引：4
研究了抗生素种类、继代和菌液浓度对农杆菌介导籼稻转化的影响，并将反义蜡质基因导入4个高产、直链淀粉含量高的籼稻品种中。结果显示，羧苄青霉素的抑菌效果优于头胞霉素，其适宜浓度为250～350mg/L；4个品种继代愈伤比初代愈伤能获得更高的抗性愈伤得率；各个品种转化有其最佳的农杆菌菌液浓度（OD600值），茉莉新占和绿黄占为1．0，粤香占和矮秀占为0．6。应用此优化的农杆菌转化体系，我们得到了转化植株；PCR扩增和Southem杂交结果证明外源基因已经整合到转基因水稻的基因组中。 相似文献
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用根癌农杆菌介导法转化大豆萌动子叶节细胞 总被引：2，自引：0，他引：2
利用根癌农杆菌转化萌动大豆成熟子叶节获得了高频率的转基因大豆。从萌发12～16 h的大豆种子切取半片种子作为目标组织,对其子叶节组织进行伤处理后,接种于含有pGB载体的LBA4404农杆菌溶液。pGB载体含有除草剂（phosphinothricin, PPT）抗性基因bar和绿色荧光蛋白基因sgfp。将接种的外植体分别在含有3或5 mg/L PPT的芽诱导培养基、3 mg/L PPT的芽伸长培养基及2～4 mg/L PPT的根诱导培养基上进行了筛选。利用萌发5 d的外植体进行PPT浓度筛选的结果表明,芽诱导、芽伸长及根诱导阶段的PPT浓度分别为5、3及3 mg/L时,转化效率达到最大值,为5.3%。PCR和Southern杂交结果证实了外源基因稳定地整合在大豆基因组中。Northern杂交和GFP分析结果表明被整合的外源基因在大豆细胞中得到了稳定的表达。成熟植株对体外喷洒100 mg/L PPT溶液产生抗性。转化效率达8.9%。 相似文献
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以白菜型油菜（Brassica rapa）的亚种菜心（Brassica parachinensis）的子叶和下胚轴为外植体,研究了卡那霉素、潮霉素、羧苄青霉素和头孢霉素4种抗生素对菜心子叶和下胚轴愈伤组织诱导和生长的影响,以及羧苄青霉素和头孢霉素对农杆菌LBA4404的抑制效果。结果表明：卡那霉素、潮霉素对菜心子叶和下胚轴愈伤组织的诱导有较强的抑制作用,卡那霉素作为抗性筛选剂,子叶的筛选浓度为10 mg/L,下胚轴的筛选浓度为15 mg/L,潮霉素作为筛选剂,子叶的筛选浓度为8 mg/L,下胚轴的筛选浓度为6 mg/L;羧苄青霉素、头孢霉素对菜心子叶和下胚轴的愈伤组织的诱导影响较小,对农杆菌LBA4404有较强的抑菌作用,作为抑菌剂羧苄青霉素、头孢霉素的浓度以200~400 mg/L为宜。 相似文献
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含硫氨基酸基因植物表达载体的构建及对百脉根的转化 总被引：2，自引：0，他引：2
在本研究中,用限制性内切酶Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ从中间载体pMD18zeolin和pMD18zein 上切下zeolin基因(约1 600bp)和γ-zein基因(约720 bp),将其定向连接在经相同酶切的质粒载体pCAMBIA1302上,构建成植物表达载体pCBzeolin和pCBzein.采用冻融法将pCBzeolin和pCBzein导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404,利用该菌株转化百脉根(Lotus corniculatus L.).经过共培养、筛选分化、再生,得到抗件植株.对抗性植株进行了PCR、RT-PCR检测表明,γ-zein和zeolin基因已经整合到百脉根基因组中,在核酸水平得到了表达.含硫氨基酸数据分析表明,转zeolin基因植株含硫氨基酸含量极显著高于转γ-zein基因植株和对照植株的含量(P＜0.01),但转γ-zein基因植株与对照植株间差异不显著. 相似文献