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本试验旨在优化电转染电压并构建转基因体细胞,为生产转基因广西巴马小型猪打下技术储备。以新生广西巴马小型猪肾脏成纤维细胞和pEGFP-N1为材料、以细胞存活率和转染率为电转染效率评价指标,筛选最佳电压,然后用优化电压进行电转染并经G418抗性筛选获得转基因体细胞系,通过体细胞核移植技术获得转基因克隆胚胎。本研究筛选出最佳电压为120 V,用优化电压进行电转染并成功构建表达GFP的转基因细胞,最后通过体细胞核移植成功获得表达GFP的转基因克隆胚胎。结果表明优化的电转染电压可以高效构建广西巴马小型猪转基因体细胞,并可通过体细胞核移植生产转基因克隆胚胎。 相似文献
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通过对猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代的研究,摸索出一套猪体细胞的分离、培养和传代的方法,建立了猪的供体细胞系。研究结果表明:猪的卵丘细胞单层的生长需要5~6 d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞,组织块法单层的生长需要10~11 d,酶消化法需要8~9 d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系,这些供体细胞培养方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞材料来源。 相似文献
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不同类型的转基因细胞为核供体生产猪的转绿色荧光蛋白基因克隆胚胎 总被引：1，自引：0，他引：1
2005年我国获得了体细胞克隆猪的成功,但是在体细胞转基因克隆猪方面还处于起步阶段。猪的转基因克隆在农业和医学方面有着巨大的应用前景,在农业上可以提高猪肉品质和培育抗病猪种等;医学上可以为人类异种器官移植、疾病模型和新药筛选提供理想材料。体细胞核移植结合基因组修饰技术,是目前生产转基因家畜的一种有效方式。供体细胞的类型是影响转基因克隆效率的一个关键因素,因为供体细胞的类型决定着体细胞转基因效率和重组胚的发育潜力。目前所知,较成功用于生产转基因克隆猪的供体细胞仅限于胎儿成纤维细胞,因为它易培养、增殖期限长、重构胚的发育能力高。此外骨髓间充质细胞,一种成体干细胞,作为转基因克隆猪的供体细胞有着巨大的潜力,国内外仅有个别报道。前脂肪细胞,一种易于获得的体细胞,有报道称利用成年猪前脂肪细胞为核供体构建的克隆胚发育能力和胎儿成纤维细胞相当,并且获得了克隆猪的后代。而利用猪前脂肪细胞生产转基因克隆胚胎,将为后续组织工程研究奠定基础。因此本研究选择猪胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞和前脂肪细胞为转基因克隆的供体细胞,目的是比较不同类型转基因供体细胞对生产克隆胚胎效率的影响。本研究首先建立了近交系五指山小型猪(WZSP)胎儿成纤维细胞系(FF)、新生猪骨髓间充质细胞(MSCs)系和成年猪前脂肪细胞系(PreA)。采用组织块法建立胎儿(27日龄)成纤维细胞系;髓间充质细胞从新生猪后腿骨冲取骨髓,加入到Percoll分离液中离心,吸取中间界层面细胞,贴壁法培养骨髓间充质原代细胞,培养基为低糖DMEM。对间充质细胞向脂肪细胞进行诱导分化,油红O染色鉴定;前脂肪细胞从猪的皮下脂肪取样,用0.1%胶原酶消化法建立前脂肪细胞原代细胞,并对前脂肪细胞进行诱导分化为成熟的脂肪细胞,油红O染色鉴定。为了获得转基因细胞系,利用脂质体lipofectamineTM2000(Invitrogene)介导的方法将质粒pEGFP-N1转染了胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞和前脂肪细胞,经过800μg/mL G418筛选后均获得了阳性细胞株。分别以3种类型转基因和未转基因细胞为核供体进行猪的体细胞核移植,比较克隆胚胎的发育能力。结果如下:(1)比较了3种类型非转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿成纤维细胞(8.2%)、骨髓间充质细胞(7.1%)和前脂肪细胞(8.8%)囊胚发育率差异不显著(P>0.05);(2)比较了3种类型转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿成纤维细胞(9.6%)和骨髓间充质细胞(9.9%)最高,前脂肪细胞(3.7%)最低,前两者与后者差异显著(P<0.05);(3)分别比较了每一类型供体细胞转基因和非转基因对重组胚的囊胚发育率的影响,转基因对胎儿成纤维细胞(9.6%vs 8.2%)和骨髓间充质细胞(9.9%vs 7.1%)的重构胚囊胚发育率影响不大(P>0.05);前脂肪细胞转基因重组胚的囊胚发育率显著降低(3.7%vs 8.8%,P<0.05)。以上结果表明,某些供体细胞类型转基因与否对猪克隆胚胎的早期体外发育影响不明显,有些细胞类型转基因对克隆胚的发育能力影响较大。通过体细胞核移植技术,猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞可以有效地生产猪转基因囊胚,但前脂肪细胞转基因克隆胚胎的囊胚发育率能否进一步提高,还需要进一步的实验观察。 相似文献
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microRNA对细胞的增殖和分化有着重要的调节作用,从大白猪(Susscrofa)基因组DNA上扩增microRNA-378-1前体序列,经XhoⅠ酶切后回收相应片段,连接到pEGP-miR载体中,构建重组载体pEGP-miR-378-1,转染猪胎儿成纤维细胞系(PEF),通过荧光观察转染效率及报告基因的表达效率,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)测定细胞内microRNA-378-1的表达活性。结果表明,成功地构建了重组载体pEGP-miR-378-1;荧光观察转染后的细胞,显示有较高的转染效率,报告基因有较高的表达效率;QRT-PCR结果显示,实验组和对照组microRNA-378-1表达显著提高,实验组和对照组细胞间差异极显著(P<0.01);为制备转基因动物研究microRNA-378-1功能提供技术平台。 相似文献
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溶葡球菌酶(Lysostaphin)是一种含锌的单链蛋白酶,能有效地杀灭金黄色葡萄球菌.内溶素(Endolysin)是双链DNA噬菌体所特有,是一类胞壁质水解酶,具有广泛的抗菌效果.内溶素与抗生素之间有高效的协同作用.本研究通过BTX电转染和AMAXA核转染的方法将含有溶葡球菌酶(Lysostaphin)和内溶素(Endolysin)两个目的基因(Seq2和Seq3)及绿色荧光蛋白(enhencedgreenfluorescent protein,EGFP)和新霉素(neomycin,neo)两个标记基因的载体pBC1-seq2+seq3-EGFP-neo,导入牛(Bos taurus)胎儿成纤维细胞,经荧光观察、G418筛选和PCR鉴定后建立稳定转染的单克隆阳性细胞系.以其作为核供体,体细胞核移植制备转基因胚胎.通过4组不同转染程序(A-023,V-013,V-023和T-016)转染牛胎儿成纤维细胞,结果表明,转染参数T-016最适合本实验,其AMAXA转染效率(20.11％)为BTX电转染转染效率的5倍.转基因囊胚率为(20.08±4.19)％,并发育正常.本研究建立了牛胎儿成纤维细胞系,筛选出高效的转染参数,并获得了含溶葡球菌酶、内溶素的转基因细胞系和转基因囊胚,为制备抗乳房炎转基因牛及寻找防治奶牛乳房炎新途径提供了技术支持. 相似文献
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乳腺生物反应器细胞模型建立的问题探讨 总被引：5，自引：0，他引：5
乳腺生物反应器的细胞模型是一乳腺细胞体外培养体系。在此体系中我们可以在分子或细胞水平上对乳腺细胞表达内源或外源基因进行精细调控。这种体系的主要用途是检验用于制备乳腺生物反应器的基因构建或生产有价值的生物活性蛋白。乳腺生物反应器的细胞模型涉及多方面的问题，人们尚没有系统研究，本文就其中几个关键问题，如乳腺细胞培养，细胞分化功能的维持与诱导，激素与乳蛋白基因表达的关系等提出来进行讨论，以期找出建立乳腺 相似文献
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利用转基因小鼠表达法氏囊病毒A片段的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
摘要： 将法氏囊病毒(IBDV)A片段定向连于乳腺特异性表达载体p7GMB53, 用于转基因实验, 用PCR和Southern杂交对阳性小鼠及其后代进行检测。 共注射了879枚小鼠受精卵, 移植受体26只, 产仔39只。 经PCR检测阳性6只（其中2只死胎）,Southern杂交检测确定了2只阳性小鼠(1公1母)。外源基因整合的拷贝数分别为3拷贝（公）和9拷贝（母）。将两只阳性小鼠进行了传代,实验表明二者分别为种系纯合体及种系嵌合体。 ELISA 及Western blot检测认为阳性母鼠表达了IBDV 衣壳蛋白。初步验证了先前构建的含基质附着区序列（MARs）的乳腺表达载体能克服转基因的位置效应,实现转入目的基因的表达,提高乳腺反应器的制备效率。 相似文献
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利用微滴数字PCR分析转基因生物外源基因拷贝数 总被引：8，自引：0，他引：8
微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是一种基于泊松分布原理的核酸分子绝对定量技术,在核酸分子的绝对计数/定量领域具有极大的应用潜力。本研究基于ddPCR平台,以转基因水稻(Oryza sativa)T1c-19和转人乳铁蛋白基因基因山羊(Capra hircus)134为例,建立了转基因生物(genetically modified organisms,GMOs)外源基因拷贝数分析方法,并比较了其与传统的实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和Southern blot方法的准确性。实验数据表明,T1c-19的杀虫晶体蛋白基因(insecticidal crystal protein,Cry1C*)在qRT-PCR和ddPCR测定结果比较一致,约为2拷贝,但已报道的Southern blot分析结果为1拷贝;ddPCR对bar基因的分析结果高于qRT-PCR,分别为2.09拷贝和1.51拷贝。转人乳铁蛋白基因(human lactoferrin,HLF)山羊134在qRT-PCR和ddPCR的分析结果基本一致,均测得含有1拷贝的HLF基因。研究结果表明,微滴数字PCR方法是一种经济、快速和准确的外源基因拷贝数分析新方法,灵敏度和准确性高,将会在拷贝数分析中广泛应用。 相似文献
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一种制备动物乳腺生物反应器的通用表达载体的构建 总被引：4，自引：0，他引：4
本文构建了一种用于制备动物乳腺生物反应器的通用表达载体，这种载体含有牛αｓ１－酪蛋白基因的表达调控序列，在５′和３′调控区之间，存在多克隆位点，便于各种不同外源目的基因的插入，两侧存在罕见的单一酶切点，从而可以构建成为理想的转基因结构。 相似文献
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指导外源基因在动物乳腺特异性表达载体的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
为了实现外源蛋白质在动物乳腺中特异性表达,采用PCR法扩增了BLG 3'端含第6,7外显子及poly(A)加尾信号下游约200 bp的0.87 kb片断.以山羊BLG 5'的3.2 kb(含第1,2外显子)启动子,山羊BLG 3' 0.87 kb序列,鸡 -珠蛋白基因簇基因上游的 2.4~ 5.3 kb HindⅢ序列,绿色荧光蛋白GFP及原核载体pGEM-7zf构建了pGEM-7zf-GFP-MAR-5' BLG-3' BLG的乳腺特异性表达载体,将外源基因插入BLG 5'端EcoRⅠ位点,或许可能实现其在乳腺中位置独立性表达. 相似文献
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牛皮肤成纤维细胞的分离培养与人溶菌酶基因的转染研究 总被引：2，自引：0，他引：2
摘要：为得到转染人溶菌酶基因的核供体细胞,采用组织块贴壁法分离培养牛耳成纤维细胞,经传代纯化培养,绘制生长曲线,将纯化好的带有人溶菌酶和绿色荧光标记基因的载体用脂质体法转入第4代成纤维细胞。24 h后荧光显微镜下检测到有绿色荧光蛋白表达,经500mg/ml G418筛选2周后,G418减半继续培养2～3代 ,PCR检测到有目的条带,说明目的基因已成功导入,因此本研究中获得的转基因牛耳成纤维细胞可能作为体细胞核移植的供体细胞进行转基因克隆牛研究。 相似文献
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研究了水牛胎儿成纤维细胞（buffalo fetal fibroblasts,BFF）转染外源基因后的细胞生物学特性。纯化含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和新霉素抗性基因的线性化载体,用脂质体法转染体外培养3代的BFF细胞,应用抗生素G418筛选2周后挑取转基因抗性细胞集落扩大培养。结果发现：经过G418筛选后细胞增殖活力下降,胰蛋白酶消化法共分离获得162个转基因水牛阳性细胞集落,转移到24孔板扩大培养后,132个（85．2％）细胞集落可以存活,转移到4孔板中后仅有52个（32．1％）细胞集落能继续生长,最终能在35mm培养皿中大量培养的只有15个（〈9．3％）。抗性细胞由梭形、成簇生长变为多角形、不规则形弥漫生长,立体感减弱,细胞生长速度减慢,活力下降。染色体核型异常率增加,10个抗性细胞集落核型正常率平均为61％,显著低于对照组86．7％（P〈0．01）。研究结果为建立和优化BFF细胞转染外源基因平台奠定了工作基础。 相似文献
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摘 要：小球藻繁殖快,培养简单,用转基因小球藻表达目的基因产物具有重要的应用前景。本研究构建了兔防御素NP-1的植物表达载体,NP-1由Ubiquitin启动子控制,含NPTII基因和硝酸还原酶基因两个筛选标记。以椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)硝酸还原酶缺失突变体nrm-4为受体,采用原生质体转化的方法将目的基因转入该突变体中。用含G418的硝酸盐培养基筛选出阳性藻落,经PCR和RT-PCR检测,证明获得了转基因藻株。转基因藻株在无抗生素筛选压力的硝酸盐培养基上继代培养后进行抑菌活性检测。研究表明,转基因椭圆小球藻表达的NP-1具有正常的生物活性,并在无抗生素的培养基中稳定遗传。本研究的结果为小球藻表达外源基因提供了新的技术途径,也为NP-1的规模化生产奠定了基础。 相似文献
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由于猪的器官极可能成为人类未来器官的供应源,猪体细胞核移殖及转基因等方面的研究已成为全球的热点。近几年来,猪体细胞核移植研究取得了一定的进展,但总体来看核移植效率还很低(1%~2%),还需要不断完善核移植程序及对一些基础问题的深入研究。本文主要对猪体细胞核移植重构胚发育异常及“印迹”基因表达特征作一综述与分析,旨在为研究者提供一些有益的启示。 相似文献
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体细胞克隆的效率一直较低,这可能与成熟前卵母细胞的质量有关。猪卵母细胞主要来源于屠宰场的废弃卵巢,这暗示,卵母细胞可能处于发情周期的各个阶段。因此,体细胞核转移之前有必要筛选优质卵母细胞。本研究旨在探讨亮甲酚蓝染色筛选及曲古抑菌素A(TSA)对东北野猪(Sus scrofa ussuricus)核移植胚发育的影响。卵丘卵母细胞复合体经亮甲酚蓝(BCB)染色后分三组:BCB+组(胞质着色,葡萄糖-6-磷酸脱氧酶(G6PDH)活性低)、BCB-组(胞质未着色,G6PDH活性高)和对照组(不使用亮甲酚蓝染色)。卵母细胞体外成熟培养后,对卵母细胞进行核移植操作,来源于BCB+卵母细胞的核移植胚使用50nmol/LTSA处理,未使用TSA处理的来源于BCB+卵母细胞的核移植胚作为对照组。结果表明,BCB+卵母细胞的直径显著大于BCB-组(P<0.05)。来源于BCB+卵母细胞的核移植胚的初次卵裂时间要早于BCB-组及对照组。来源于BCB+卵母细胞的核移植胚的囊胚形成率显著高于BCB-组及对照组(P<0.05)。且50nmol/LTSA处理可将来源于BCB+卵母细胞的核移植囊胚率提高到(29.6±2.8)%(P<0.05)。总之,来源于BCB+卵母细胞的核移植胚发育能力较强,且50nmol/L的TSA可促进重构胚的体外发育。对卵母细胞进行BCB染色筛选并使用50nmol/L的TSA处理重构胚,可提高东北野猪核移植重构胚的发育能力,为通过体细胞克隆法保护东北野猪资源创造条件。 相似文献
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基因修饰猪作为一种理想的动物模型已应用于生物医学研究。构建基因修饰猪的方法很多,包括原核注射、慢病毒转染、精子介导和体细胞核移植等,其中体细胞核移植具有显著优势,一直是构建基因修饰猪的重要方法。近几年,随着转座子、设计核酸酶等基因修饰新技术以及诱导性多能干细胞研究的不断进展,将进一步凸显体细胞核移植技术在基因修饰猪构建中的价值。本文比较了猪基因修饰的主要方法,并论述体细胞核移植技术在猪基因修饰中的优势、发展历程和最新应用等。 相似文献
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多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究 总被引：1，自引：0，他引：1
在转基因动物的研究中,一般采用随机插入的方法。基因在受体动物的基因组中随机整合,严重制约了转基因动物外源基因的稳定遗传,是转基因动物研究亟待解决的问题。转基因定点整合技术,即基因打靶技术是解决上述问题的重要途径,但是基因打靶存在打靶效率太低的问题。本研究小组已建立了体外动物细胞的多位点基因打靶技术,并构建了用于鳜鱼的体内多位点基因打靶的打靶载体,本文开展多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究。以鳜鱼rDNA基因(编码rRNA的基因)及其间隔序列作为同源重组引导序列,构建含干扰素基因的打靶载体,以其间隔序列为靶位点,针对鱼类胚胎发育特点,采用精子介导技术进行多位点基因打靶,最终获得定点整合干扰素基因的鳜鱼,并建立一套适用于动物的基因定点敲入的体内基因打靶技术。主要研究内容如下:(1)采用组织培养方法,获得鳜鱼头肾淋巴细胞和脾淋巴细胞,采用脂质体介导法使多位点基因打靶载体在鳜鱼的细胞上实行基因转移。采用正负筛选方法,利用筛选药物G418和GCV(更昔洛韦)筛选转染后的细胞两周后,对存活细胞进行DNA水平和RNA水平鉴定。结果证明了干扰素基因在鳜鱼细胞上实现了定点整合和稳定表达。(2)利用精子介导法将经线性化处理后的多位点基因打靶载体在鳜鱼的胚胎上实行基因转移。(3)根据靶位点定点整合的正负筛选原理,利用筛选药物G418和GCV筛选与富集定点整合后的阳性鱼胚或鱼苗,结果成功孵化出106尾转基因鳜鱼鱼苗。(4)培育6个月后,取20尾转基因鳜鱼进行鉴定。采用PCR、RT-PCR、测序等方法进行定点整合的鉴定。结果表明:6尾检测到已转入的基因——干扰素基因,其中有3尾实现了定点整合并表达。本研究率先将多位点基因打靶技术应用到转基因鱼的研究中,建立一套适用于鱼类的高效、安全的多位点基因打靶技术,并获得外源基因定点整合并表达的鳜鱼。 相似文献
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α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义。本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,将其转染至猪(Susscrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞。根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-Zs Green1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-Zs Green1-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-Zs Green1-opLA和pIRES2-Zs Green1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到。本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞。 相似文献
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摘要：为构建重组人红细胞生成素（hEPO）真核表达载体，应用PCR及人工合成方法获得除第一内含子的hEPO基因组基因，并将其插入载体pIRES2-AcGFP1，成功构建hEPO基因和AcGFP1共表达载体phEPO-IRES-AcGFP1，然后用脂质体法使该载体转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）及山羊成纤维细胞，于转染后48h在荧263光显微镜下观察到绿色荧光。经G418筛选，在荧光显微镜下发现成簇的绿色荧光细胞，说明重组质粒被成功导入细胞并表达AcGFP1，为鉴定hEPO转染成功与否及阳性细胞筛选提供了方便。 相似文献