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1.
香菇反转录转座子间扩增多态性（IRAP）PCR反应体系的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
摘 要：为了开发香菇反转录转座子间扩增多态性标记(IRAP),建立稳定的IRAP-PCR反应体系,本文对影响IRAP-PCR的主要因素进行了优化筛选。确定了最佳反应体系为：20μl反应体系中,包含30 ng模板DNA,0.30μmol/L引物, 0.3mmol/L dNTPs,2.0 mmol/L Mg2+及0.75UTaq酶。梯度PCR试验筛选得到的最佳退火温度为56.1℃。采用上述最佳反应体系和引物LTR1L-MarY1L对香菇18个菌株进行了IRAP-PCR扩增,验证了该体系的可靠性。 相似文献
2.
金银花ISSR-PCR反应体系的建立与优化 总被引：3，自引：0，他引：3
以金银花叶片基因组DNA为模板,通过单因素试验,研究了退火温度、Taq DNA 聚合酶的用量及模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+浓度等6种因素对ISSR－PCR扩增的影响,建立了适合于金银花ISSR-PCR反应体系和扩增程序,即在20 μL反应体系中,内含1×PCR反应缓冲液（Mg2＋free）、1.5 U Taq DNA 聚合酶、0.15 mmol·L-1 dNTPs、0.4 μmol·L-1引物、1.5 mmol·L-1 MgCl2、60 ng模板DNA。确定了适宜的退火温度为49.9 ℃。扩增程序为94 ℃预变性5 min ;35个循环为94 ℃变性30 s,49.9 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min;最后72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。利用优化反应体系,从100条ISSR引物中筛选出10条稳定性和重复性高的引物;以这10条引物对22个金银花品种基因组DNA扩增,共扩增出108条带,其中多态性条带96条,多态性条带比率为88.9%。金银花ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行金银花品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础。 相似文献
3.
风信子ISSR-PCR体系的优化及引物筛选 总被引：1，自引：0，他引：1
以风信子基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对影响PCR扩增体系中Mg2+浓度、dNTPs、模板DNA及引物浓度、Taq酶的用量5个因素进行研究,建立了风信子ISSR-PCR扩增最佳反应体系,即:20μL反应体系中分别加入2μL10×Buffer、1.4μL Mg2+(25mmol/L)、1.5μL dNTPs(2.5mmol/L)、1.5μL引物(10pmol/μL),0.2μLTaq酶(5U/μL),1.2μL模板(30ng/μL),ddH2O补足体积。并以此体系对110条引物进行筛选,最终获得了多态性高,重复性好的引物12条。 相似文献
4.
直接扩增甜瓜小卫星DNA指纹图谱 总被引：4，自引：0，他引：4
以小卫星DNA YNZ22核心序列为引物,甜瓜DNA为模板,在甜瓜上研究了直接扩增小卫星DNA(DAMD)的优化反应体系,结果表明:在20μL的反应体系中,5种主要成分Taq DNA聚合酶、Mg2 、引物、模板DNA和dNTPs的最适浓度分别为1U,2.5 mmol/L,0.5 mmol/L,30 ng,5 mmol/L。在优化的DAMD-PCR反应体系下,利用该引物在28个甜瓜品种上构建了直接扩增小卫星DNA(DAMD)的指纹图谱,分析结果表明,该引物在28个甜瓜品种上共扩增出13位点,其中9位点具有多态性,多态性条带比率为69%,可一次性从28个甜瓜品种中鉴别出其中的21个,鉴别率高达75%。 相似文献
5.
利用NCBI数据库进行小麦条锈菌看家基因SNP引物开发,从NCBI搜索到15个基因的序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了22对引物,利用其进行条锈菌DNA的PCR扩增、测序,并与标准序列比对,从而筛选出SNP引物。在候选基因中,柠檬酸盐合酶(Cs)、热休克蛋白hsp90(Hsp)、泛素活化酶E1(Uba)及泛素结合酶E2(Ubc)4个基因的5对SNP引物表现多态性,能检测到条锈菌SNP位点依次为4、6~7、4和7个,均为系统发生信息位点,并摸索出优化的PCR反应体系及条件。利用开发的引物研究条锈菌群体结构,可揭示病原菌起源、进化、传播,为病害治理提供依据。 相似文献
6.
《分子植物育种》2017,(8)
以珍稀濒危植物香果树(Emmenopterys henryi)基因组DNA为研究对象,对影响SRAP-PCR反应的因素如Mg~(2+)浓度、d NTPs浓度、Taq DNA聚合酶、引物浓度4因素进行优化。确定香果树SRAP反应体系为:20μL PCR反应体系,50 ng模板DNA,1×Buffer,2.5 mmol/L Mg~(2+),1 U Taq聚合酶,0.3 mmol/L d NTPs,正向和反向引物各0.3μmol/L;在香果树2份样品中进行引物初筛,利用已发表的SRAP引物,选取8条正向引物和8条反向引物,共计64对引物。从中筛选出10对重复性好,谱带清晰且稳定的引物。并将这些引物在香果树2个野生居群20份样品中进行遗传多样性分析,共得到72条扩增谱带,其中多态性谱带60条,多态性比率83.3%,平均每个引物组合产生6个多态性位点,供试材料间遗传变异相对丰富。 相似文献
7.
柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系的建立与优化 总被引：16，自引：0，他引：16
通过对PCR反应程序、反应体系(DNA模板量、PCR反应体积、Mg2 浓度、dNTP浓度、Taq酶用量、引物量)、电泳检测方法的系统优化,建立了柑桔SRAP-PCR和ISSR-PCR体系;以此进行大规模引物筛选,从而建立了柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系.SRAP-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10 mmol/L,KCl50 mmol/L,Mg2 1.2 mmol/L,dNTP 120 μmol/L,Taq酶1.5U,引物0.4μmol/L,反应程序为94℃预变性5min,35个循环(94℃ 30s,47℃ 1min,72℃ 1min),72℃延伸10min;ISSR-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10mmol/L,KCl50mmol/L,Mg2 1.6 mmol/L,dNTP200μmol/L,Taq酶1 U,引物0.8μmol/L.筛选出稳定性好、多态性高的24对SRAP引物和13条ISSR引物. 相似文献
8.
适合于狗尾草属遗传分析的ISSR标记筛选及反应体系优化研究 总被引：1，自引：1，他引：0
利用公共数据库已有的ISSR序列信息,检验了29条ISSR引物在谷子等狗尾草属植物基因组的扩增性,其中14条在狗尾草属中有良好扩增,其余15条在狗尾草属中无任何扩增。能稳定扩增的14条引物全为3'-锚定引物,6条5'-锚定引物在狗尾草属中得不到扩增。研究发现AG,GA和CA重复的引物在狗尾草属植物有较好扩增,且多态性强。利用正交试验设计,从Mg2 、dNTP、引物、Taq酶4种因素、4个水平对狗尾草属谷子ISSR反应体系进行优化,确定了适合谷子的ISSR反应体系,在20μL体系中,含1×PCR buffer、Mg2 浓度2.0 mmol/L,dNTP浓度0.25 mmol/L,Taq酶0.4μL,引物浓度0.25μmol/L,50 ng模板,通过梯度PCR确定了引物的退火温度。本研究筛选的ISSR引物及建立的优化反应体系可用于谷子等狗尾草属植物遗传多样性和基因组研究,并对其他近缘作物有指导意义。 相似文献
9.
《分子植物育种》2017,(2)
以尾叶桉、细叶桉、粗皮桉为材料,采用L16(45)正交设计对SSR-PCR反应体系中的引物浓度、DNA浓度、Mg2+浓度、d NTP浓度和Taq酶含量5种因素的4个水平进行优化实验,确立了适合细叶桉、粗皮桉、尾叶桉SSR-PCR最佳反应体系,最终优化的SSR-PCR反应体系为:0.25μmol/L引物、5 ng模板DNA、3.75 mmol/L Mg2+、0.4 mmol/L d NTP、1.5 U Taq酶、1 m L 10×PCR Buffer,双蒸水补齐10μL;并利用优化的体系从74对SSR引物中筛选出12对多态性较高的引物,12对引物在3种桉树中均能扩增出条带,在尾叶桉、细叶桉、粗皮桉中的多态率分别为100%、92.86%、64.29%,为尾叶桉、细叶桉、粗皮桉的遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系分析等提供了分子技术基础。 相似文献
10.
橄榄SRAP-PCR体系的建立和优化 总被引：2，自引：0，他引：2
以橄榄品种为材料,采用L16（45）的正交试验设计,对影响PCR反应的Taq酶量、Mg2+浓度、模板DNA含量、dNTPs浓度和引物浓度5个因素进行了SRAP-PCR扩增反应条件优化研究,并利用反应体系对11个橄榄品种进行了SRAP-PCR扩增。结果表明：在20μl体系中,Taq酶1.5U、Mg2+2.5 mmol/L、模板DNA 60ng、dNTPs 0.2 mmol/L和引物0.15μmol/L时的扩增效果最好;利用该体系,SRAP标记引物对Me5- Em2在11个橄榄品种中可以扩增出7条清晰的多态性条带。 相似文献
11.
为了建立光萼荷属植物(Aechmea) SRAP-PCR反应体系,为今后光萼荷属植物种质资源研究提供技术支持,本研究通过L16(45)正交试验设计,对光萼荷属植物SRAP反应体系中的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA浓度等5个因素进行优化实验,并筛选多态性SRAP引物组合。结果表明,光萼荷属植物的最佳SRAP反应体系为1.50 mmol/L Mg2+、400 μmol/L dNTPs、1.5 U Taq DNA聚合酶、15 μmol/L引物、30 ng模板DNA及1×PCR buffer。各因素对SRAP-PCR扩增反应结果影响的差异较大,依次为模板DNA>Taq DNA聚合酶>dNTPs>引物>Mg2+。从56对SRAP引物组合中筛选出51对扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物组合,多态性引物比率达90%以上。通过不同光萼荷属植物和不同引物组合对该反应体系进行验证,均获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,表明本研究建立的光萼荷属植物SRAP-PCR反应体系稳定可靠。 相似文献
12.
为构建高密度苦瓜SSR分子标记遗传图谱,利用正交设计L16(45)对苦瓜SSR-PCR体系进行优化。采用该体系和本实验室开发的300对SSR引物对4种表型差异较大的苦瓜材料基因组DNA进行了多态性引物筛选,并用筛选出来的多态性引物对黄瓜、甜瓜、西瓜、丝瓜、冬瓜、南瓜进行了PCR扩增,研究了苦瓜SSR引物对6种瓜类作物扩增的通用性及多态性。优化后的SSR反应体系为:d NTPs(2.5 mmol/L)0.5μL、Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.1μL、10×PCR-Buffer 1.5μL、SSR引物(10μmol/L)0.6μL、模板DNA(100 ng/μL)70 ng,总反应体系为10μL。在苦瓜300对SSR引物中,筛选出49对条带清晰的多态性引物,多态性比率为16.3%。其中苦瓜SSR引物对黄瓜、甜瓜、西瓜、丝瓜、冬瓜、南瓜扩增的通用性分别为61.2%、51.0%、59.2%、57.1%、49.0%、59.2%;每个物种不同类型间的多态性比率排序为丝瓜(22.4%)西瓜(16.3%)甜瓜(14.3%)、冬瓜(14.3%)黄瓜(8.2%)南瓜(2.0%)。即有棱丝瓜和无棱丝瓜之间、圆形西瓜和椭圆形西瓜之间多态性较高,瓜用南瓜和叶用南瓜之间多态性比率最低。说明部分苦瓜的SSR标记在其他葫芦科作物中具有通用性,并且在不同物种间扩增多态性存在明显差异,本研究将为葫芦科其他作物分子标记研究及后续苦瓜分子标记辅助育种和比较基因组等方面的研究和应用提供依据。 相似文献
13.
药用菊花SSR-PCR反应体系优化及引物筛选 总被引：5，自引：0，他引：5
为进一步开发利用药用菊花种质资源和开展分子标记辅助选择育种,本研究利用L25(56)正交设计对影响药用菊花SSR-PCR反应的模板DNA、Mg2+、d NTPs、Taq酶、引物等5个因素进行优化,并对SSR引物进行筛选。结果建立了药用菊花SSR-PCR最佳反应体系(20μL):模板DNA 60 ng,正、反向引物0.25μmol/L,d NTPs 0.3 mmol/L,Mg2+3.0 mmol/L,Taq酶1.5 U。运用优化后的反应体系,从136对引物中成功筛选出了扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物57对,大多数条带大小集中在100~500 bp,不同引物扩增的条带数为5~15条。优化的SSR-PCR反应体系在多个药用菊花品种遗传多样性研究中得到了验证,获得了稳定性、重复性良好和多态性丰富的扩增图谱。该体系的建立可为今后利用SSR标记对药用菊花种质鉴定、遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供了依据。 相似文献
14.
马铃薯种质遗传多样性分析的AFLP反应体系优化与引物筛选 总被引：3，自引：0，他引：3
本试验主要对AFLP反应体系进行优化,并用该体系筛选适用于马铃薯种质资源遗传多样性分析的引物。酶切连接、预扩增和选择性扩增体系的优化结果表明,建立的马铃薯AFLP反应体系为:模板DNA160ng,37℃酶切连接12h;预扩增体系中dNTP浓度为0.2mmol/L,TaqDNA聚合酶用量为1U;选择性扩增体系中预扩增产物稀释20倍,引物终浓度为2.5ng/μL。利用优化后的AFLP反应体系,以5个马铃薯品种为试材筛选选择性引物,可以从81对引物组合中选出16对条带丰富且多态性较高的引物组合。本研究为种质资源鉴定、马铃薯遗传多样性以及马铃薯抗病性研究等奠定了良好的基础。 相似文献
15.
本研究以大麻嫩叶为材料,以改进的SDS法,提取了高质量的大麻基因组DNA,经过酶切、连接、预扩增、选择性扩增、银染等试验条件的优化,建立了AFLP反应体系。研究结果表明:在常规的SDS提取液里加入8μL/mLβ-巯基乙醇(V/V)和3%PVP(M/V)能够提取到高质量的适用于AFLP的基因组DNA;选取150ng大麻基因组DNA来进行酶切,EcoRⅠ和MseⅠ各0.5U,在37℃酶切4h,即可完全酶切。最优的选择性扩增体系为20μL反应体系中含有1.0U Taq DNA polymerase、1.0μL25mmol/L Mg2+、0.4μL10mmol/LdNTPs、50ng/μL引物各1.0μL、4.0μL稀释50倍的预扩增产物及2μL10×PCR Buffer;使用该方法,获得了清晰、稳定的图谱并筛选到了18对多态性较好的AFLP引物组合。 相似文献
16.
《分子植物育种》2020,(12)
为建立郁金香SSR-PCR反应体系,本研究以36个荷兰引进的郁金香栽培品种和5个产于中国新疆的野生种为试验材料,采用单因素试验和L_(16)(4~5)正交设计相结合的方法,对影响郁金香SSR-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA、Taq酶用量进行优化,建立最佳的SSR-PCR反应体系,并利用3对引物在41份郁金香材料中验证反应体系的稳定性。结果表明:在20μL的PCR反应体系中,10×PCR Buffer (Mg~(2+)free) 2μL、Mg~(2+)2.0 mmol/L、dNTPs 0.75 mmol/L、引物2.0μmol/L、模板DNA 10 ng、Taq酶0.15 U为最优体系;通过正交试验确定5个因子对SSR-PCR体系的影响程度为:模板DNATaq酶引物Mg~(2+)d NTPs。筛选出的3对引物在41份郁金香材料中均可扩增出目的条带,表明该体系的稳定性好。本研究建立SSR-PCR反应体系,为郁金香SSR标记的开发以及遗传多样性分析、品种指纹图谱构建、种质资源鉴定等方面提供了帮助。 相似文献
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建立最适的PCR反应体系是成功进行ISSR-PCR的关键,且反应的扩增效果易受多种因素的影响,本研究采用正交试验和单因素筛选试验两种方法,选用凤仙花叶片DNA为实验材料,针对影响凤仙花ISSR-PCR反应较大的 Mg~(2+)、dNTPs、Taq酶、引物、模板DNA这5个因素进行优化并筛选,最终建立凤仙花ISSR-PCR最佳反应体系:25μL PCR反应体积中, Mg~(2+)浓度为2.0 mmol/L、引物浓度为0.4μmol/L、模板DNA浓度为150 ng、dNTPs浓度为0.15 mmol/L、Taq酶为0.5 U。利用该体系筛选出14条可用于凤仙花ISSR-PCR扩增的引物。通过建立凤仙花属最佳ISSR-PCR反应体系,为研究凤仙花属植物提供分子标记水平上的理论依据和技术方法。 相似文献
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牡丹杂交品系SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选 总被引：2，自引：2，他引：0
通过研究牡丹杂交新品系的遗传多样性,解决其在牡丹品种分类体系中位置的问题。利用正交设计,从Mg2+、dNTPs、引物浓度、DNA聚合酶和不同模板DNA浓度5种因素4个水平来优化牡丹杂交品系SRAP-PCR反应体系,对引物进行筛选。建立牡丹杂交品系SRAP-PCR反应最佳体系(25 μL)为： 2.0 mmol/L Mg2+、1.5 U Taq酶、0.25 mmol/L dNTPs、2 ng/μL模板DNA、0.25 μmol/L引物;运用试验结果从100对引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物30对。优化体系的建立及引物的筛选,可为利用SRAP标记技术研究牡丹杂交品系的遗传多样性及亲缘关系提供技术基础和理论依据。 相似文献
19.
《分子植物育种》2020,(17)
SSR-PCR反应体系的建立与优化是凤仙花属植物(Impatiens L.) SSR标记研究的基础,本研究以8种凤仙花属植物为试材,对Mg~(2+)、Taq酶、dNTPs浓度、DNA模板、引物浓度等5因素进行L_(16)(4~5)正交试验,探讨适合凤仙花属植物的SSR-PCR反应体系,并对主要因素进行优化。结果表明:Mg~(2+)、Taq酶和dNTPs浓度3个因素对凤仙花属SSR-PCR扩增结果有显著影响,影响程度为Mg2+Taq酶dNTPs浓度DNA模板引物浓度;20μL为最佳反应体系,其中,2.6 mmol/L (含10×PCR Buffer)的Mg~(2+),1.6 mmol/L的dNTPs,2μmol/L的引物,60 ng的DNA,0.1 U的Taq酶,ddH_2O补齐剩余部分。利用优化后的反应体系对同属54种材料进行PCR扩增,扩增产物在130～200 bp,具4个等位基因,目标条带清晰,多态性良好。该体系的建立可为今后利用SSR标记对凤仙花种质鉴定、遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供了依据。 相似文献
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甘肃金鳟是我国自主培育的虹鳟新品种,为进行其种质资源研究和遗传管理,以其尾鳍为试验材料,提取基因组DNA,对影响甘肃金鳟扩增片断长度多态性(AFLP)反应体系进行优化,包括模板DNA浓度、基因组酶切时间、选择性扩增中Mg2+、预扩增产物稀释倍数及选扩性引物M+3/E+3配比等进行比较分析,建立了适于甘肃金鳟的AFLP反应体系。即：100 ng 基因组DNA,3 U EcoR I 37℃酶切3 h,再 Mse I 65℃酶切5 h;然后用1 U的T4连接酶连接12 h, 选扩25 μl PCR反应体系中Mg2+2.0 mmol/L,预扩产物稀释30倍,选扩引物M+3/E+3配比为8∶1,所得产物经电泳和银染后可获得清晰条带,效果良好;筛选出了适宜甘肃金鳟品种分析的13对选择性引物。 相似文献