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猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S蛋白5′端基因重组腺病毒的构建及其免疫特性 总被引：1，自引：0，他引：1
RT-PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）S蛋白基因5′端包含B、C抗原位点的1.0kb DNA片段,并与穿梭载体pShuttle-CMV连接;然后与腺病毒（Adenovirus）骨架载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌（Es-chenchia coli）BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒。该重组腺病毒质粒转染HEK293细胞并进行噬斑纯化,获得了1株含有TGEV S蛋白5′端基因的重组人复制缺陷型血清5型腺病毒rAd-TGEV-S。随后用RT-PCR和间接免疫荧光（indirect immunofluorescent assay,IFA）检测目的基因的转录与表达。重组腺病毒rAd-TGEV-S在HEK293细胞连续传代9次后,病毒效价稳定,滴度平均为10^7.7TCID50／mL。动物免疫试验显示,rAd-TGEV-S可以诱导小鼠产生TGEV特异性IgG和IgA。 相似文献
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通过双酶切将伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)Fa株gC囊膜糖蛋白基因片断亚克隆到5型腺病毒AdMax系统穿梭质粒pDC316中，得到pDC316-gC。用此质粒与腺病毒DNA辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染293细胞,初步成功包装出重组腺病毒Adv-gC。进一步通过PCR鉴定和病毒空斑纯化，得到纯的高效价Adv-gC病毒液。间接免疫荧光实验证明此重组病毒能表达PRV gC蛋白。该病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,结果表明能诱导小鼠产生特异的体液和细胞免疫反应，即针对gC蛋白的总抗体IgG、针对PRV的中和抗体和足垫迟发型超敏反应DTH。攻毒实验表明，此重组病毒能提供100％的免疫保护，而对照组为0%。表达PRV gC基因复制缺陷型重组腺病毒的构建及其免疫效果的初步测试，为研制PRV新型活载体疫苗奠定了基础。 相似文献
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通过双酶切将伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)Fa株gC囊膜糖蛋白基因片段亚克隆到5型腺病毒AdMax系统穿梭质粒pDC316中,得到pDC316-gC。用此质粒与腺病毒DNA辅助质粒pBHGloxΔ E1,3Cre共转染293细胞,包装出重组腺病毒Adv-gC。通过PCR鉴定和病毒空斑纯化,得到纯的高效价Adv-gC病毒液。间接免疫荧光实验证明此重组病毒能表达PRV gC蛋白。该病毒经肌注免疫Balb/c小鼠,能诱导小鼠产生特异的体液和细胞免疫反应。攻毒试验表明,此重组病毒能提供100%的免疫保护。 相似文献
4.
Dvl1及其结构缺失突变体ΔDIX（dsh and axin）和ΔDEP（dsh,Egl-10 and pleckstrin）腺病毒载体的构建并验证其在MSCs（mesenchymal stem cells）中的表达情况。将目的基因定向克隆至pAdTrack-CMV穿梭载体上,并经PmeⅠ线性化后在BJ5183细菌中与pAdEasy-1骨架质粒同源重组,获得重组腺病毒载体,在QBI-293A细胞中包装及扩增,实时荧光定量PCR和Western bolt验证Dvl1在MSCs中的表达情况。经PCR、PacⅠ单酶切鉴定及测序分析,成功构建Ad-Dvl1、Ad-ΔDIX和Ad-ΔDEP腺病毒载体,目的基因序列与GenBank报道一致,并选出150 MOI为最适感染MSCs的感染复数,成功构建了Ad-Dvl1、Ad-ΔDIX和Ad-ΔDEP腺病毒载体,并获得高滴度的病毒子,qPCR和Western blot证实Dvl1在MSCs中高表达并增加了β-catenin在细胞中的累积,为进一步研究Dvl1在MSCs迁移过程的作用奠定了基础。 相似文献
5.
固醇调节元件结合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2,SREBP2）属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子家族,在胆固醇的代谢过程中具有重要的调控作用。克隆秦川牛（Bos taurus）的SREBP2基因并构建相应腺病毒过表达载体,包装扩繁获得高滴度腺病毒,对于在细胞水平上研究SREBP2基因的功能和作用机制具有重要作用。本研究以秦川牛脂肪组织为实验材料,提取总RNA并反转录为cDNA,依据GenBank收录的牛的SREBP2基因（Accession No.NM001205600）mRNA序列设计引物,克隆出SREBP2基因编码区（coding sequence,CDS）全长。将SREBP2基因与穿梭载体连接构建pAdTrack-CMV-SREBP2表达载体,用PmeⅠ分别酶切线性化pAdTrack-CMV-SREBP2和空白对照pAdTrack-CMV载体并转化含有骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌（Escherichia coli）BJ5183感受态进行同源重组,得到腺病毒重组载体pAd-SREBP2和pAd-CMV,分别用PacⅠ酶切后胶回收DNA大片段,并将回收产物转染293A细胞包装得到腺病毒Ad-SREBP2和Ad-CMV,增殖并提高病毒滴度,得到高滴度病毒后,用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记法测定显示Ad-SREBP2和Ad-CMV的病毒滴度分别为7×108和1.3×109GFU/mL。将Ad-SREBP2和Ad-CMV腺病毒侵染秦川牛前体脂肪细胞检测病毒的有效性,实时定量PCR检测结果显示,侵染48h时SREBP2基因的表达量提高了102.3倍。本研究成功克隆了秦川牛的SREBP2基因,构建了病毒重组体,包装增殖获得了高滴度病毒,为在细胞水平上基因功能的研究提供了基础资料。 相似文献
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N端融合TAT穿膜肽的piggyBac转座酶的原核表达及其在HEK 293细胞中的功能验证 总被引：1，自引：0，他引：1
为了增加piggyBac(PB)转座系统在转基因操作中安全性和减少PB转座系统的辅助质粒带来的副作用,本研究利用N端融合人免疫缺陷病毒反式激活因子(Human immunodeficiency virus transactivator,TAT)穿膜肽的原核表达PB转座酶替代辅助质粒在人肾胚细胞(HEK293细胞)介导PB转座的发生,同时建立一种由TAT介导的外源功能蛋白进入真核细胞的方法。构建了N端和C端分别融合TAT的PB转座酶原核表达载体(pET28A-Pbase 1,pET28A-Pbase 2)。利用pET28A-Pbase1载体在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中成功表达出N端含有TAT的PBase重组蛋白,纯化并对其进行蛋白定量,然后以100mg/mL的浓度加入细胞培养液中,转导进入HEK 293细胞,利用免疫荧光技术观察该酶能否进入HEK293细胞核,利用热不对称PCR(Tail-PCR)进行整合位点侧翼DNA序列检测,亚甲蓝进行阳性细胞克隆染色并利用非配对t检验统计细胞克隆数。聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot鉴定结果表明PBase在大肠杆菌中成功表达,经分析发现其主要以可溶蛋白形式存在。免疫荧光结果表明,N端融合TAT穿膜肽的PBase定位于细胞核,但是整合位点检测和转座效率统计结果表明,原核表达的PBase蛋白在HEK 293细胞中无法介导转座事件的发生。该转座系统能否在其他真核细胞中正常发挥作用,还需要进一步的研究。然而,本研究为由TAT穿膜肽介导的外源蛋白在真核细胞中的跨膜转运提供了一种可靠的方法。 相似文献
7.
采用PCR方法从绿脓杆菌ATCC27853菌株基因组扩增其外毒素A（PEA）全长编码基因,并将PEA基因插入到pcDNA3.1A真核表达载体中,构建成pcDNA3.1/ PEA质粒表达载体。经磷酸钙介导将重组质粒转染 HEK293T 细胞进行表达。结果表明本文克隆的PEA基因与标准菌株PA103碱基序列基本相似,同源性达99%。表达产物经蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测,表明本文构建的含有原基因信号肽的PEA基因能够在真核细胞进行分泌性表达,这为基于PEA的免疫毒素、疫苗佐剂和疫苗载体的研究奠定了基础。 相似文献
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猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的高度接触性传染病.TGEV的S、N基因具有重要的免疫学功能,构建S、N双基因疫苗将能提供更好的免疫效果.本研究用RT-PCR扩增S基因抗原区(2.1 kb,含A、B、C和D完整的抗原位点)和N基因编码区(1.2 kb),分别定向插入双启动子真核表达载体pVAXD的多克隆位点(MCS),构建了单价质粒pVAXD-N和pVAXD-S,然后将N基因插入pVAXD-S中,构建了双启动子真核表达质粒pVAXD-N/S.将pVAXD-N/S与对照组(pVAXD-N、pVAXD-S和pVAXD)转染COS-7细胞进行表达鉴定,用RT-PCR可从pVAXD-N/S转染细胞中扩增出s、N两个目的基因,IFA鉴定结果显示,pvAXD-N/S可同时表达S、N两种目的蛋白.初步的小鼠(Mus musculus)免疫试验结果显示,pVAXD-N/S免疫小鼠后第14天即可检测到抗TGEV的IgG抗体,第35天抗体达最高峰,pVAXD-N/S诱导的抗体水平显著高于单基因质粒组pVAXD-N和pVAXD-S的抗体水平(P＞0.5),与混合质粒(pVAXD-N+pVAXD-S)诱导的抗体水平相当.本研究结果表明,构建的双启动子表达载体pV AXD-N/S具有S、N基因的双重免疫功能,为TGEV新型双基因疫苗研究提供了基础材料. 相似文献
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摘要：本实验从质粒pGEM-HA中扩增H5N1亚型禽流感病毒HA基因，构建转移载体pFastBacHT-HA并与E.coliDH10Bac中的Bacmid质粒重组，构建重组转座质粒rBacmid-HA。在脂质体介导下将rBacmid-HA转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。在sf9昆虫细胞中表达HA蛋白，通过SDS-PAGE、Western blot和血细胞吸附实验鉴定重组蛋白。结果显示重组HA蛋白分子量约为66kDa，该蛋白与AIV H5亚型鸡血清发生特异性反应，与H7、H9亚型鸡血清不反应，转染重组杆状病毒后的细胞能吸附鸡的红血球，证明HA基因在sf9昆虫细胞中获得了正确表达，不仅具有型特异性，而且有良好的生物反应性。 相似文献
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以乙肝表面抗原S基因为载体,分别将肌肉生成抑制素(myostatin)N端基因片段(MSTN)和抑制素(inhibin)N端基因片段(INH)分别插入S基因编码的C端和第112～113氨基酸残基密码子之间,构建MSTN-INH融合表达质粒pVAX-SMI.酶切和测序鉴定表明.重组质粒pVAX-SMI构建成功.脂质体法将pVAX-SMI转染HeLa细胞,Western blot检测重组蛋白的表达,结果表明,重组蛋白成功在HeLa细胞中表达. 相似文献
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应用PCR技术从含有猪resistin基因(Retn)cDNA的质粒pMD18T-Retn中扩增Retn基因片段,将其克隆至pcDNA3.1( )表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Retn。采用LipofectaminTM2000转染Hela细胞,用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。用RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE和Western blot技术检测,结果表明Retn基因在Hela细胞中得到转录与表达。 相似文献
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α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义。本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,将其转染至猪(Susscrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞。根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-Zs Green1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-Zs Green1-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-Zs Green1-opLA和pIRES2-Zs Green1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到。本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞。 相似文献
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参照GenBank中小反刍兽疫病毒((Peste des petits ruminants virus,PPRV)N基因序列（Nigeria/75/1）(1 578 bp)设计了1对添加EcoRⅠ和Not Ⅰ酶切位点的引物,对从奥地利引进的pCI-neo-PPRN质粒进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,并转化大肠杆菌Escherichia. coli TOP10感受态细胞,获得重组质粒pGM-T-PPRN。将重组质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的产物插入原核表达载体pET-32a（+）,构建原核表达质粒pET-PPRN,将其转化进BL21(DE3)感受态细胞中后用IPTG诱导表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析,结果表明小反刍兽疫病毒N基因在BL21(DE3) 成功表达。所表达融合蛋白的相对分子质量约为80 kD,并能被组氨酸单抗、PPRV标准阳性羊血清及PPRV疫苗免疫羊血清所识别。 相似文献
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猪传染性胃肠炎病毒核衣壳蛋白的表达及在ELISA中的初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
重组质粒PET-N转化大肠杆菌（Escherichia coli） BL21菌株,在1.0 mmol/L IPTG和37℃条件下诱导,外源基因获得高效表达。Western blot检测证明,表达产物具有良好的反应原性。以纯化的蛋白为抗原建立了检测猪传染性胃肠炎抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为15 μg/mL,抗体稀释度1∶40,最适封闭液为5% FBS,血清反应时间为90 min,酶标二抗HRP SPA的工作浓度为1∶5 000,反应时间为60 min,底物在室温显色时间为10 min,待检血清阳性标准定为光密度OD450≥0.35。与 Svanova TGEV/PRCV 抗体诊断试剂盒比较,此方法的特异性、敏感性和符合率分别为93.8%、93.5%和93.5%。 相似文献
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鸡、猪BPI氨基端的基因克隆和鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了克隆杀菌/通透性增加蛋白(BP I)N端cDNA,构建重组体pM D 18-T-BP I,并进行序列鉴定,应用RT-PCR技术,参照G enB ank报道的预测序列,从鸡多形核白细胞(PM N)mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白(BP I)氨基端95个氨基酸的基因片段,并与pM D 18-T连接,构建BP I氨基端的基因重组体,进行酶切鉴定和序列测定;从猪PM N的总mRNA中扩增出BP I氨基端48个氨基酸的基因片段,进行测序鉴定。获得鸡BP I N端长度为285 bp的基因片段。序列分析证实该片段中有3个点突变,但均不在活性中心;获得猪BP IN端长度为146 bp的基因片段。成功克隆出BP I N端基因,经序列测定,确认为BP I基因,为进一步表达该基因奠定了基础。 相似文献
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将米曲霉植酸酶基因phyA克隆于植物表达载体pB1121的CaMV35S启动子（P35s）下游,构建了含有P35s—phyA-TNOS表达盒的重组质粒pBI-phyA,并用电脉冲法将其导人大肠杆菌中。通过三亲接合将pBI—phyA质粒由大肠杆菌导入根癌农杆菌LBA4404菌株,获得带有phvA基因的根癌农杆菌工程菌株LBA4404／pBI-phyA。用LBA4404／pBI—phyA转化木薯外植体652个,在含100mg／L卡那霉素和250mg／L氨苄青霉素的MS分化培养基上诱导分化芽,获得24株抗卡那霉素转化苗。以转化苗和未转化植株的总DNA为模板,用phyA基因的同源序列为引物,进行聚合酶链式反应（PCR）,结果表明9株转化苗的PCR结果为阳性,初步证明目的基因phvA已经转入木薯中。 相似文献