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为了分离获取高产量、高活力的桑树原生质体,分别以桑树的组培苗细切叶片、胚性悬浮培养细胞、粗切愈伤组织和细切愈伤组织等为材料,采用正交试验和单因素试验的方法对桑树原生质体酶解分离条件中的分离酶液组合、渗透压调节剂、酶解温度、酶解时间等因素进行优化。最佳分离酶液组合为100 U/mL纤维素酶R-10+150 U/mL果胶酶Y-23+6 U/mL离析酶R-10+细胞-原生质体洗液(1 480 mg/L CaCl2.2H2O,27.2 mg/L KH2PO4),以0.6 mol/L甘露醇为渗透压调节剂,在28℃酶解温度条件下酶解6 h,用桑树胚性悬浮培养细胞作分离材料可获得7.8×106个/g的原生质体产量,且原生质体活力达91.4%。研究结果显示,选择合适的分离材料以及酶解分离条件是高效获取高活力桑树原生质体的关键。 相似文献
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为了应用原生质体技术改良桑树内生产油真菌Macrophomina phaseolina MOD-1的产油性能,对影响MOD-1原生质体制备的酶液组分、菌龄、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂种类等因素进行优化。通过正交试验得到最佳酶液组合为:20mg/mL纤维素酶+20 mg/mL溶菌酶+5 mg/mL蜗牛酶。在此基础上应用响应面分析法获得影响MOD-1原生质体产量的显著因素有菌龄和渗透压稳定剂浓度,且均产生负效应。以此作为中心点进一步优化原生质体制备条件为:培养44.58 h的MOD-1菌丝,用0.66 mol/L KCl作渗透压稳定剂,30℃条件下酶解4 h。在此优化条件下,获得的MOD-1菌株原生质体产量可达7.06×106个/mL,优化条件具有实用价值。 相似文献
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提高甘草原生质体游离产量及分裂频率的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
为探讨影响胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Batal.)原生质体游离的因素,提高原生质体游离产量和分裂频率,试验采用纤维素酶、果胶酶、离析酶不同浓度组合的酶解液,在3种酶解方式下对甘草叶片、下胚轴、愈伤组织进行了原生质体游离。结果表明:苗龄11 d的甘草叶片、下胚轴及继代5次的愈伤组织是原生质体游离的良好材料,三者均在2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶和2.0%纤维素酶+0.25%离析酶+0.5%果胶酶的酶解液中原生质体游离频率最高,其产量和活力分别为1.25×105~1.26×105个·g-1,65.7%~70.5%;1.43×105~1.44×105个·g-1,69.5%~72.8%;1.10×105~1.16×105个·g-1,61.9%~69.4%;纵向切割的下胚轴平均原生质体产量和活力高于叶片和愈伤组织,分别为1.19×105个·g-1,65.2%。此外,在40 r·min-1摇床上处理7 h的酶解混合物中原生质体产量最高;而先静置后缓慢震荡(40 r·min-1)的酶解方式可得到最佳原生质体产量和活力。将原生质体密度调整到1×105个·g-1并培养于KM8P培养基中,能获得最高频率的原生质体分裂频率(2.34%)。试验获得了较好的甘草原生质体游离及分裂体系。 相似文献
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对俄罗斯杂花苜蓿(Medicago varia)原生质体游离和培养条件进行优化,建立其原生质体融合的体细胞杂交体系.以下胚轴诱导所碍愈伤组织为材料进行原生质体游离,研究酶液组合、渗透压调节物甘露醇浓度、酶解时间、愈伤组织继代时间及预处理措施对原生质体游离效果的影响,以及激素浓度与培养密度对原生质体培养的影响.结果表明:最佳酶液组合为2％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.3％离析酶,最佳渗透压为0.55mol/L,最佳酶解时间为12h,愈伤组织继代培养至14d的游离性最佳;固—液综合培养条件下最适激素组合为1.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA,最适原生质体培养密度为3×10 5个/mL. 相似文献
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草地早熟禾午夜Ⅱ号原生质体培养及植株再生 总被引：5，自引：1，他引：4
对草地早熟禾(Poa Pratensis L.)品种-午夜Ⅱ号进行了原生质体培养及其植株再生的研究。以午夜Ⅱ号成熟种子诱导的松软胚性愈伤组织为材料,利用酶解法分离出大量有活力的原生质体。原生质体经培养,持续分裂形成愈伤组织,并分化出再生绿苗和白化苗。研究了不同酶液组成和酶解时间对原生质体游离的影响。结果表明:采用继代培养8-10 d的胚性愈伤组织在1.0%纤维素酶+1.0%离析酶+0.5%果胶酶+0.3%崩溃酶条件下,酶解14-16 h可得到产量和活力较高的原生质体。原生质体以2.0×105-5.0×105个/mL的植板密度,采用液体浅层法在附加1.0 mg/L 2,4-D、0.3 mg/L 6-BA、100 mg/L水解酪蛋白、100 mg/L水解乳蛋白、1.0%蔗糖、0.4 mol/L甘露醇的KM8P培养基中培养,可形成较小的愈伤组织。愈伤组织经过增殖在分化培养基上(MS+0.5mg/LNAA+2.0 mg/L 6-BA)可诱导芽、根的形成,再生出完整植株。 相似文献
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扁蓿豆愈伤组织原生质体分离条件的研究 总被引：5，自引：1，他引：4
以扁蓿豆(Melilotoides ruthenica(L.)Sojak)下胚轴愈伤组织为材料,研究酶液组合、酶解时间、酶液渗透压、继代培养时间及预处理措施对其原生质体分离效果的影响,以期确定能够酶解出高数量且高活力的原生质体的酶解条件。结果表明:获得有活力原生质体的最佳酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶、酶解时间为12 h、酶液渗透压即甘露醇浓度为0.55 mol·L-1,愈伤培养天数为10~12 d、预处理措施为黑暗24 h。 相似文献
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以紫花苜蓿种子为材料,研究了不同的酶解液浓度、渗透压、离心力对叶和根原生质体分离的影响,旨在获得高产量、高活性的原生质体悬浮液,以便能够使用10×Genomics平台进行单细胞转录组测序,进而了解植物细胞分化的轨迹。结果表明：适用于根的最佳酶解液浓度、甘露醇浓度、离心力分别为2%纤维素酶+1%离析酶、0.5 mol/L、300 g;适用于叶的最佳酶解液浓度、甘露醇浓度和离心力分别为1.25%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.5%离析酶、0.4 mol/L、180 g。在此条件下,根原生质体的产量和活性分别达到3.95×106个/g和81%,叶原生质体的产量和活性分别达到7.09×106个/g和71%,达到10×Genomics平台的上机标准,为进一步开展紫花苜蓿发育的分子细胞生物学研究奠定基础。 相似文献
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苜蓿愈伤组织原生质体游离与培养 总被引：7，自引：3，他引：4
对阿尔冈金苜蓿(Medicago sativa L. cv. Algonguin)原生质体游离和培养的最佳条件进行研究,建立其细胞融合原生质体杂交体系。以下胚轴诱导的愈伤组织为材料,研究了愈伤组织继代培养时间、酶液组合、酶解时间及酶液渗透压对原生质体游离的影响,并探讨了愈伤组织原生质体在KM8P培养基上的分裂情况。结果表明:继代12d的愈伤组织游离性最好,最佳酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶+1%半纤维素酶、最佳酶解时间为12h、最佳酶液渗透压为0.55mol/L;最适宜培养苜蓿愈伤组织原生质体的培养基为KM8P+2.0mg/L2,4-D+1.0mg/LNAA。 相似文献
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为了建立稳定、高效的匍匐翦股颖（Agrostis stolonifera L.）叶肉细胞原生质体瞬时表达体系，本研究以匍匐翦股颖‘Penn-A4’的叶片为材料，分析不同因素对其叶肉细胞原生质体分离的影响，确定其原生质体分离的最佳条件。结果表明：苗龄为4周的翦股颖无菌苗叶片在甘露醇为0.6 mol·L-1的酶解液中，28℃酶解4 h后，可分离得到较高活力原生质体、提取量约为6.75×106个·g-1；为进一步检测该原生质体是否可有效的应用在蛋白功能研究中，构建了热激蛋白基因AsHSP26.8-GFP重组质粒，并在聚乙二醇（PEG-4000）介导下将其导入叶肉细胞原生质体中进行了亚细胞定位；通过激光共聚焦显微镜观察到AsHSP26.8定位于叶绿体。综上所述，本研究建立了一套较为完整的匍匐翦股颖叶肉细胞原生质体分离与瞬时表达体系，为探究匍匐翦股颖的功能基因组学研究奠定了基础。 相似文献
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蛹虫草具有与冬虫夏草极相似的药理作用,可作为冬虫夏草代替品.本试验以蛹虫草菌株CM-1为出发菌株,结果表明蛹虫草菌原生质体制备的快速简便方法为:菌体液体培养96h,用0.6 mol/L甘露醇溶液作为渗透压稳定剂,取1g菌丝体以1∶20比例加入复合酶液,在pH6.8、28℃条件下酶解2.5h,获得原生质体数最多,达到5.08 × 108个/mL;原生质体再生培养基为含0.6 mol/L甘露醇PDA培养基,原生质体再生率最高为4.69％. 相似文献
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播娘蒿愈伤组织原生质体培养体系的研究 总被引：6，自引：3，他引：3
以4℃低温暗处理24 h的播娘蒿愈伤组织为分离原生质体的来源材料,采用B5、Km8p、MS 3种培养基进行液体浅层静置培养原生质体,获得了愈伤组织并分化成苗,建立了原生质体培养体系。结果表明,低温暗处理利于获得高产率高质量的原生质体;5%纤维素酶 0.5%离析酶 5 mmol/L MES酶解16 h,是最佳的酶解处理;B5培养基取得了较好的原生质体培养效果;MS 6-BA 2.0 mg/L NAA 0.2 mg/L AgNO31.7 mg/L为最佳分化培养基;MS IBA 0.5 mg/L NAA 0.5 mg/L为最佳的生根培养基。 相似文献
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为快速获得大量捕食性真菌Duddingtonia flagrans原生质体并使其再生,本试验研究了酶质量浓度、酶解温度、菌龄、酶解时间对D.flagrans原生质体产生的影响,以确定D.flagrans原生质体最佳快速制备条件。结果表明,在溶壁酶2mL/L、蜗牛酶8g/L、纤维素酶8g/L时,35℃恒温条件下,酶解菌龄为2d的菌丝7h,捕食性真菌D.flagrans产生原生质体数量最多且能够再生。这为下一步转化并标记和克隆捕食性相关基因奠定了重要基础。 相似文献
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陇东野生紫花苜蓿愈伤组织原生质体游离条件的筛选 总被引：1，自引：0，他引：1
以陇东野生紫花苜蓿子叶诱导的愈伤组织为材料,研究了酶解时间、酶液组合、酶液中甘露醇浓度、预处理措施及愈伤组织继代培养时间对其原生质体游离效果的影响.结果表明:当酶解时间为10h、酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%离析酶+0.3%半纤维素酶+0.3%崩溃酶、甘露醇浓度为0.60mol/L、预处理措施为CPW-10溶液中浸泡1h、愈伤继代培养天数为12～14d时,游离出的原生质体产量最高,可达19.5×105个/g,存活率高达89.7%. 相似文献
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为了建立以PEG介导的柳枝稷叶肉细胞原生质体瞬时表达体系,本研究以柳枝稷 Alamo品种的叶片为材料,通过设计梯度实验确定柳枝稷原生质体分离的最佳条件, 每组梯度实验重复3次, 方案如下:1)对植物培养的时间进行优化。酶解时间固定在8 h, 甘露醇浓度为0.6 mol/L, 将培养了1, 2, 3和4周的黄化苗用作实验材料;2)渗透压优化。选取2周的黄化苗为实验材料, 酶解时间固定在8 h, 甘露醇浓度分别为0.4, 0.5, 0.6, 0.7和0.8 mol/L;3)酶解时间优化。选取2周的黄化苗为实验材料, 甘露醇浓度为0.6 mol/L, 酶解时间分别为6, 7, 8, 9和10 h。通过对比分析发现,苗龄为2周的柳枝稷黄化苗叶片在甘露醇为0.6 mol/L的酶解液中, 黑暗, 28 ℃并裂解8 h后分离的原生质体最为理想。接下来构建了能够在植物细胞内表达GFP-MYB103融合蛋白(GFP为绿色荧光蛋白)的重组质粒LN-OsMYB103, 利用PEG介导法将质粒LN-OsMYB103转化进入柳枝稷原生质体, 并且在激光共聚焦显微镜下观察到了强烈的绿色荧光蛋白信号。该结果表明, 分离的原生质体可以行使正常生物学功能。综上所述, 利用柳枝稷叶片建立了一套完整的柳枝稷叶肉细胞原生质体瞬时表达体系。这将为深入开展柳枝稷的功能基因组学研究奠定了基础。 相似文献
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以华南象草(Pennisetum purpureum)幼叶鞘为材料,采用L16(45)正交试验设计,对分离原生质体过程中的纤维素酶浓度、离析酶浓度、酶解液pH、甘露醇浓度、酶解时间5个因素进行筛选,建立了高效的象草叶鞘原生质体分离体系,并进行目标基因的瞬时转化,以期为象草基因功能研究奠定基础。结果表明:叶鞘在含有1.5%纤维素酶R-10,0.75%离析酶R-10,0.5 mol·L-1 甘露醇,pH为5.8的酶解液中酶解4 h,原生质体产量达5.11×106个·g FW-1,活力达91.08%,酶解时间对象草原生质体产量和活力的影响最大。用PEG介导法将2个分别带有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的载体转入原生质体中,转化效率最高可达77.47%,共转化效率为8.79%。所分离的原生质体可用于基因的瞬时表达研究。 相似文献
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以产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis NX-FEL001为供试菌株,研究了培养方式、菌龄、酶解时间和酶解温度等,对U.oxytropis原生质体制备和再生的影响。结果表明,U.oxytropis菌丝在质量分数为10g/L纤维素酶+10g/L蜗牛酶+1g/L溶壁酶组成的复合酶溶液,35℃恒温,80r/min振荡孵育3h左右,原生质体释放量最高;原生质体在YCM培养基上,22℃培养9d可以再生形成菌落,培养15d其再生率可达8.5%;原生质体在YCM培养基上再生后其菌落颜色与野生型U.oxytropis不一致,呈现白色;菌丝形态与野生型U.oxytropis相一致,经检测再生后菌丝仍然能够产生苦马豆素。U.oxytropis原生质体的制备,将为进行疯草内生真菌的遗传转化和基因操作研究提供重要工具,为进一步开展疯草内生真菌合成苦马豆素的分子调控机制奠定了基础。 相似文献
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柱花草(Stylosanthes guianensis)是一种重要的热区豆科牧草,为利用原生质体瞬时表达体系开展柱花草基因功能研究,以20 d龄期‘热研5号’柱花草子叶为试验材料,通过正交试验考察不同因素对原生质体分离及转化效率的影响。结果表明：采用1.5%纤维素酶、1.25%离析酶、0.5 mol·L-1甘露醇和4 mmol·L-1MES酶解液组合,酶解时间为16 h时,原生质体的产量和活性均达到最佳,分别为(4.567×106)个·g-1和92.271%;原生质体浓度为(6×105)个·mL-1、质粒浓度为0.6μg·μL-1,PEG-4000浓度为50%、转化时间为5 min时,转化效率最高,可达52.524%。构建了目标蛋白SgRKL1表达载体pA7-BIUTNT::SgRKL1-GFP,利用PEG介导法将其转入柱花草原生质体,激光扫描共聚焦显微镜检测结果显示SgRKL1蛋白定位于细胞膜上,说明所建立的柱花草叶肉原生质体瞬时表... 相似文献