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1.
试验尝试构建成体细胞同小鼠早期胚胎的嵌合共生胚胎.取成年人皮肤组织的成纤维细胞,慢病毒转染皮肤成纤维细胞标记EGFP荧光蛋白,同小鼠早期8-细胞胚胎进行嵌合.结果显示慢病毒高效标记人皮肤成纤维细胞表达EGFP荧光蛋白,通过皮肤成纤维细胞与小鼠胚胎干细胞形成的拟胚体环境作用后,皮肤成纤维细胞成功与小鼠胚胎形成嵌合胚,嵌合囊胚形成率为38.08%,表达EGFP荧光蛋白的皮肤成纤维细胞能够嵌合到小鼠胚胎的不同部位.嵌合胚在胚胎干细胞分离培养环境下进行培养,嵌合到小鼠内细胞团的皮肤成纤维细胞参与小鼠内细胞团的组成,参与小鼠内细胞团组成的胚胎占嵌合胚比率为1.74%.小鼠胚胎干细胞拟胚体环境作用可以成功介导人皮肤成纤维细胞同小鼠早期胚胎形成嵌合共生体系. 相似文献
2.
FADD(Fas-associated death domain protein)存在于Fas/FasL系统中,是信号传导通路的一个信号连接蛋白,FADD通过传递凋亡信号,从而介导细胞凋亡。为进一步验证FADD基因抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用,从牛卵巢组织中扩增FADD基因,将FADD基因连接到带有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pAcGFP-N1中,构建过表达FADD基因载体,并构建FADD基因的RNAi载体;用脂质体介导法将FADD基因RNAi载体、真核表达载体转染到牛胎儿成纤维细胞中,观察有无荧光的表达,并使用Real-Time qPCR和Western blot方法检测FADD基因mRNA、蛋白水平的表达情况。结果表明:成功构建出FADD基因RNAi载体和高表达载体,重组质粒转染牛胎儿成纤维细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,转染效率可达50%。 相似文献
3.
《吉林农业科学》2014,(4):50-53
为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。 相似文献
4.
人Ⅰ型胶原基因脂质体转染牛耳细胞克隆筛选方法 总被引：1，自引：0，他引：1
构建连接有人Ⅰ型胶原基因的质粒(PGCl-collagen).利用脂质体介导的方法转染荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,优化一系列转染条件以提高转染效率,再利用G418和GFP荧光的表达来筛选稳定转染的细胞,最后以末转染的成纤维细胞作为阴性对照组,PGCl-collagen作为阳性对照组对转染的细胞进行PCR验证.结果显示:在6孔培养板中细胞融合度达到50%～60%左右介导1～3μg重组质粒转染24 h,转染效率可达25%～30%,筛选单克隆细胞在荧光显微镜观察检测到绿色荧光蛋白的表达.在使用800U的G418筛选效果最好,维持浓度300～600U,获得25个稳定表达的阳性细胞系.从中选取6个克隆进行PCR验证.成功利用脂质体转染方法将人I型胶原基因成功转染到荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,PCR验证结果正确. 相似文献
5.
组织蛋白酶Z基因(Cathepsin Z gene, CTSZ)是影响猪生长、肉质等性状的一个重要候选基因.本研究以长白猪的背最长肌为试验材料,采用RT-PCR的方法克隆CTSZ基因CDS序列全长,对该序列进行了生物信息学分析,并构建pEGFP-N1-CTSZ融合表达载体,通过脂质体介导瞬时转染猪成纤维细胞,30 h后进行荧光表达检测.结果本试验克隆出猪CTSZ基因CDS全序列912 bp,并成功构建pEGFP-N1-CTSZ融合表达载体,瞬时转染后在猪成纤维细胞中表现为绿色荧光蛋白表达.本试验为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础. 相似文献
6.
为了构建α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体及提供山羊乳腺生物反应器α-乳清蛋白核移植供体细胞,提取乳腺组织中的总RNA,采用RT-PCR技术获得α-乳清蛋白基因cDNA,测序酶切后连接乳腺特异性表达载体pBCⅠ-Neo,并对重组载体进行酶切测序鉴定;取重组正确的载体酶切线性化后利用脂质体介导转染至山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选培养转染了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞。结果显示:经过RT-PCR特异性扩增克隆出α-乳清蛋白基因;克隆的基因碱基组成序列经测序与预期完全一致,α-乳清蛋白基因片段正向插入乳腺特异性表达载体;重组载体在山羊胎儿成纤维细胞中稳定转染,转入α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞生长迅速,仍保持原有的细胞生长形态。成功构建了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体,获得稳定转染的山羊胎儿成纤维细胞可用于核移植。 相似文献
7.
《吉林农业》2014,(4)
目的:构建携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和miR-505基因的慢病毒载体。方法:采用PCR方法从pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-505表达载体质粒扩增出miR-505 shRNA基因编码区173bp、175、171bp片段,通过限制性酶切、T4DNA连接酶连接,分别将miR-505 shRNA基因插入慢病毒表达载体FUGW与L26Fsy(1.1)GW中,构建成重组载体FUGW-miR-505-3p/5p/nc与Fsy-miR-505-3p/5p/nc。脂质体介导下将慢病毒重组载体转染至HEK 293T细胞,通过EGFP观察转染效率,RT-PCR方法检测miR-505的表达量。结果:荧光显微镜下观测到HEK 293T细胞转染后有较强绿色荧光;RT-PCR显示转染FUGW-miR-505-3p/5p与Fsy-miR-505-3p/5p的HEK 293T细胞中对应miR-505-3p/5p明显升高。结论:成功构建带有EGFP和miR-505-3p/5p/nc shRNA基因的慢病毒表达载体。 相似文献
8.
克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞 #br# 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosin beta 4,Tβ4) 基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM 2 000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】 克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142 bp,其中包含135 bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(XM002706880.1)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。 相似文献
9.
《中国农业科学》2010,(21)
【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosinbeta4,Tβ4)基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142bp,其中包含135bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(NM_001002885)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。 相似文献
10.
采用RT-PCR法对海兰鸡MyoD全长cDNA序列进行扩增,克隆、测序后,构建真核表达载体pEGFP-N1-MyoD,脂质体瞬时转染鸡胚成纤维细胞,用荧光显微镜、RT-PCR和SDS-PAGE电泳法检测MyoD蛋白表达情况.结果表明,构建的真核表达载体pEGFP-N1-MyoD能成功转染鸡胚成纤维细胞;荧光显微镜观察可见绿色荧光;RT-PCR可见目的条带;SDS-PAGE 电泳证明表达的蛋白相对分子质量为33KD,该结果为研究MyoD蛋白的功能奠定了试验基础. 相似文献
11.
目的方法结果结论（HPV）-16 E6DNA HPV-16 E6（PLIG）（PLIG-E6）293T NCIH460 G418 4 DNA PCR Western blotting NCIH460 HPV-16 E6 DNA NCI-H460 HPV-16 E6 DNA HPV-16 E6探讨慢病毒法建立人乳头瘤病毒癌蛋白表达肺癌细胞株的可行性。采用重组技术将基因插入到含有增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒质粒载体中,获得重组慢病毒载体,经双酶切和测序鉴定正确后,与慢病毒包装载体一起转染细胞,收集病毒液,测定滴度后,感染肺癌细胞株。经筛选培养周后,提取细胞基因组和蛋白,分别用和方法分析细胞中和蛋白的表达。双酶切及测序结果表明重组慢病毒表达载体构建成功;感染慢病毒液的细胞中可检测出和蛋白表达。用慢病毒法成功构建稳定高表达癌蛋白的肺癌细胞株。 相似文献
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根据雌激素类化合物在机体内的作用机理，以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报告基因构建了4个启动子不同的表达载体(pERE-SV-EGFP, pERE-TA-EGFP, pERE-CMV-EGFP, pERE-TK-EGFP)。以这些表达载体瞬时转染MCF-7细胞，报告基因的基础表达与启动子的强度相关。以17β-雌二醇(E2 ,10-9 mol·L-1)诱导表达载体瞬时转染的MCF-7细胞，发现在表达载体pERE-TA-EGFP、pERE-TK-EGFP、pERE-SV-EGFP转染的MCF-7细胞中，E2能诱导2倍以上的报告基因的表达。这表明在这些瞬时表达系统中报告基因的表达是雌激素依赖性的，因此这些表达载体可用于稳定转染以建立稳定表达分析系统。 相似文献
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为了构建tTS真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系,采用PCR方法,以质粒pTet-tTS为模板扩增tTS基因的编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pApoE-rtTA-Neo,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用RT-PCR、Western blot法检年测tTS的表达,成功构建了pApoE-rtTA-tTS-Neo真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的基因。真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究tTS的功能奠定良好的实验基础。 相似文献
14.
以陕北白绒山羊毛囊生长期皮肤组织cDNA为模板,扩增出Lhx2基因的CDS区,成功构建了以KAP6.1为启动子表达Lhx2基因的绿色荧光表达载体pIRES2-KAP-LHX-EGFP.并利用脂质体介导转染绒山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系,经PCR检测显示外源基因已整合到细胞基因中.研究结果为进一步开展Lhx2基因对绒山羊毛囊发育的影响和转Lhx2基因绒山羊的生产提供了前期研究基础. 相似文献
15.
为研究人CD46(hCD46)基因启动子的启动特性,研制具有hCD46组织特异性表达特征的转基因小鼠,设计扩增hCD46基因启动子的PCR引物,用HeLa细胞基因组DNA为模板扩增hCD46基因启动子DNA片段,测序结果表明:其序列与GenBank中hCD46完整基因5′端某片段的同源性高达99.9%。用此DNA片段替换表达载体pcD-NA3EGFP中的CMV启动子,且在该片段与EGFP基因之间插入兔β-球蛋白基因的第2内含子RGI。重构的表达载体在2种鼠源细胞CHO和SP2/0中均可启动EGFP表达,表达量与人体内同源组织中hCD46的相似,说明该研究克隆了结构和功能正确的hCD46基因启动子。 相似文献
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肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)又称GDF-8,属于转化生长因子超家族,是在骨骼肌中广泛表达的一类糖蛋白。试验根据已知牛MSTN基因的序列设计引物,通过PCR技术克隆获得同源长短臂,利用pPNT质粒为骨架构建含有loxP-Neo-loxP结构的打靶载体,然后利用脂质体转染鲁西黄牛成纤维细胞,G418和GANC双向筛选,收集打靶细胞,PCR法进行鉴定,初步确定筛选到的细胞为MSTN基因敲除细胞,为后续试验获得MSTN基因敲除牛奠定了基础。 相似文献
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克隆了牛的myf6基因并构建真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6,用脂质体技术转染鲁西黄牛成纤维细胞,通过G418筛选出稳定转染的细胞株,利用Western印记、Real-time PCR技术检测myf6对成纤维细胞的影响。结果表明,与对照组相比,稳定转染后的成纤维细胞myf6蛋白和mRNA的表达量提高(P0.01),肌肉肌酸激酶基因mRNA表达量升高(P0.05),肌球蛋白轻链基因的mRNA表达量也提高(P0.01)。细胞形态观察显示转染后的成纤维细胞未融合为肌管。由此可知,牛myf6基因可以在成纤维细胞中表达并且有促进成纤维细胞向肌肉细胞分化的功能。 相似文献
18.
【目的】建立绵羊(Ovis aries)诱导性多能干细胞系,为绵羊转基因育种、应用绵羊诱导性多能干细胞奠定基础。【方法】利用电转将OCT4、SOX2、KLF4、l-Myc、Lin28转染至绵羊成纤维细胞中并诱导培养至有光滑隆起、边缘整齐的细胞克隆,形态学、碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光染色以及实时荧光定量PCR检测克隆细胞的生物学特性;利用高通量测序技术对诱导0、10、20、30 d的阳性细胞的差异表达基因进行筛选。【结果】克隆细胞中SOX2、OCT4、SSEA-1蛋白免疫荧光染色均呈阳性; OCT4、SOX2、Nanog基因表达量均极显著高于成纤维细胞;0和30 d转录组测序表明,被注释到GO数据库的差异表达基因有9 465个,其中,上调基因6 987个,下调基因2 478个;KEGG分析共有5 773个基因注释到259个通路中,其中,P53信号通路显著富集,且其在干细胞增殖方面起着非常重要的作用。【结论】初步成功建立了绵羊诱导性多能干细胞。 相似文献
19.
为构建绵羊血管内皮生长因子(VEGF)基因siRNA载体并对其在绵羊颗粒细胞中的表达,采用DMEM/F12培养液对绵羊卵巢颗粒细胞进行体外培养,采用脂质体转染法将干扰载体转染到颗粒细胞中,用ELISA试剂盒测定转染后各组颗粒细胞中VEGF的表达量。转染阳性对照载体PGC的颗粒细胞组为对照组,转染PGC-1、PGC-2和PGC-3的颗粒细胞组分别为试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和试验组Ⅲ。与对照组相比,各试验组中VEGF的表达量分别降低了55.37%、81.45%和73.29%,其中载体PGC-2所转染的细胞中VEGF的表达量最少,说明在3个载体中,PGC-2对VEGF的基因沉默效果最好。 相似文献