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1.
蛋白质组样品制备主要涉及蛋白质的提取和酶切处理,是蛋白质组学分析的限制环节之一。为了提高作物叶片蛋白质组样品制备的效率和重复性,系统比较了6种缓冲液（pH8.5 Tris-HCl酚、pH7.0磷酸盐、pH9.0碳酸盐、尿素/硫脲、pH8.0 Tris-HCl、pH4.5醋酸盐）和TCA-丙酮处理对水稻、小麦、大豆和玉米叶片蛋白质提取的影响,同时以小麦叶片总蛋白和牛血清白蛋白为样本,比较了传统方法和微波辅助方法的酶切效率。结果表明,TCA-丙酮处理的小麦和水稻样品采用尿素/硫脲方法能获得较高的蛋白得率,而玉米和大豆样品采用尿素/硫脲直接提取时蛋白质得率更高,同时,微波辅助酶切值得用于蛋白质组样品制备。本研究采用适当的蛋白质提取和酶切方法,有效提高了蛋白质的提取率和鉴定率,可为进一步深入开展作物叶片的蛋白质组学研究提供借鉴。 相似文献
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以萝卜‘NAU-JLQX09’叶片为材料,分别采用Tris-HCl/TCA-丙酮沉淀法和改进的PEG分级沉淀法提取蛋白质,通过双向凝胶电泳技术比较两种方法的效果.结果表明,应用Tris-HCl/TCA-丙酮沉淀法提取的蛋白2-DE图谱可识别出640个蛋白点;而改进的PEG分级沉降法的蛋白组分(F1,F2以及F3) 2-DE图谱可清晰识别蛋白点数目分别为537,170与852,总蛋白点数目多且高丰度蛋白RuBisCO主要被沉降在F2中,F3中分离到更多的低丰度蛋白点.因此,在进行萝卜叶片蛋白质组分析时,采用PEG分级沉降法提取叶片蛋白,可获得较高质量的2-DE凝胶图谱.研究结果为应用蛋白质组学解析萝卜重要性状形成分子基础提供了良好的技术支持. 相似文献
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蛋白质提取方法和电泳条件是蛋白质组学研究中双向电泳的关键。本文初步建立起一套适合圆果种黄麻功能叶总蛋白双向电泳(2-DE)分析的高效提取方法及电泳条件,在双向电泳技术中,比较了TCA丙酮、Tris-base/丙酮、Tris-HCl的蛋白提取方法,并优化了上样量和样品制备方法。结果表明, TCA丙酮法提取蛋白质产量高,达79.0 mg g–1,比Tris-base/丙酮法和Tris-HCl的产量分别高出44.2%和114.1%。该法得到的2-DE图谱背景清晰,蛋白点数最多,约602个,较其他两种方法更适合用于黄麻功能叶总蛋白双向电泳分析;350 mg为最佳上样量。这为黄麻蛋白质组学后续研究奠定了基础。 相似文献
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适于SDS-PAGE分析的苹果叶片蛋白质提取方法 总被引：7，自引：0，他引：7
为探索苹果叶片蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析的样品制备方法,比较了三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法、改良的Tris-HC1法、酚-甲醇/醋酸铵沉淀法、二硫苏糖醇(DTT)/丙酮法及Tris-HC1法等5种蛋白质的提取方法.制备的样品经SDS-PAGE分离采用银染显色.结果表明,改良的Tris-HC1法在加大PVPP用量和蛋白质提取缓冲液的基础上,将丙酮沉淀蛋白质的时间由30 mln增加到1 h,使蛋白质的得率最高为3.243μg/μL,上样量5μL得到的蛋白质条带数量最多,条带最清晰为41条.利用这一改良方法对苹果实生树不同节位蛋白质的动态变化进行了研究,共发现6条蛋白质差异带,分子量分别为71.9,60.5,52.6,41.1,35.3,18.5 kDa,条带清楚,背景清晰.因此,改良的Tris-HC1法适用于苹果叶片的SDS-PAGE分析. 相似文献
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目的:建立一套适用于甘草种子蛋白质提取及SDS-PAGE电泳的技术体系,为甘草种子纯度检测提供技术支撑.方法:对甘草种子蛋白质的8种提取方法进行了筛选,在此基础上进一步比较不同的分离胶浓度、不同料液比对甘草种子蛋白质SDS-PAGE电泳的影响,并采用该技术方法对乌拉尔甘草和胀果甘草种子进行鉴定.结果:巯基乙醇法和丙酮沉淀法是适宜的蛋白质提取方法,巯基乙醇法得到12条带,丙酮沉淀法得到9条蛋白质条带,且背景颜色较浅,适宜于进行种子纯度检测.10％分离胶和1∶10的料液比电泳效果较好.乌拉尔甘草和胀果甘草种子有蛋白质条带的差异.结论:建立了一种高质量的甘草种子蛋白质样品的制备方法及SDS-PAGE电泳技术,可用于甘草种子纯度检测. 相似文献
7.
《华北农学报》2015,(6)
对棉花根系蛋白的双向电泳提取技术进行改良,以获得更好的分离效果,为棉花根系蛋白质组学研究奠定基础。以鲁棉研28为材料,分别采用TCA/丙酮法、改良TCA/丙酮/SDS法、饱和酚-甲醇醋酸铵法这3种根系蛋白质提取方法,提取棉花幼苗根系总蛋白,并进行双向电泳进行蛋白质分离。在蛋白质含量、蛋白纯度和电泳图谱等方面对3种方法进行比较。利用饱和酚-甲醇醋酸铵提取法提取的棉花根系蛋白,其蛋白样品纯度高,SDS-PAGE电泳图谱清晰,蛋白点数量最多为601个点;TCA/丙酮法提取得到的蛋白总量最高约为7.53 mg/g,但样品纯度低,SDSPAGE电泳图谱模糊,蛋白点数量最少为417个点。采用考马斯亮蓝染色,上样量为1 500μg获得的凝胶图谱效果较好。总之,适合棉花根系蛋白质提取的方法为饱和酚-甲醇醋酸铵法,在考马斯亮蓝染色蛋白质上样量为1 500μg时能获得优良的分离效果。 相似文献
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以甜菜抗病和感病材料为试验材料,对田间产量进行了比较。通过比较蛋白质垂直电泳图谱,比较了TCA/丙酮沉淀法、可溶性蛋白提取法和酚提取法3种不同蛋白质提取方法,水培进行病毒胁迫处理后,通过Image Master 2D Platinum Trial 5. 0软件分析,扣除差异蛋白点,进行胶内蛋白质鉴定分析。结果表明:3种蛋白质提取方法中的TCA/丙酮沉淀法提取效果较好。田间产质量比较显示,抗病材料在苗期及生长后期长势要优于感病材料,收获后块根产量和含糖量也要高于感病材料,抗病材料表现良好。蛋白质双向电泳后通过软件分析,扣除具有明显差异的蛋白点78个,总共鉴定出了34个有效蛋白质ID,通过NCBI和The Beta vulgaris Resource数据库Blast比对发现,病1和病2主要表达的功能蛋白以光合作用、糖代谢、呼吸抗氧化作用、信号转导、脂代谢及一些未知蛋白为主,而病5和病6主要表达光合作用蛋白和呼吸抗氧化蛋白,即自身应激反应所表达的蛋白质。 相似文献
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为比较不同方法提取的玉米叶片蛋白质对双向电泳效果的影响。采用TCA-丙酮沉淀和TRIzol试剂盒2种方法,提取国审玉米品种郑单958叶片全基因组蛋白质,并对提取的蛋白质样品进行双向电泳。结果表明:TCA-丙酮方法提取的蛋白质一向水平聚焦电压上升缓慢且达不到程序设置的电压,而TRIzol试剂盒方法实时监测图与程序设置图相吻合;对电泳胶图分析后可知,TRIzol试剂盒法分离出的蛋白点多于900个,低丰度蛋白质得到充分显现,大多数蛋白点分子量为20~80 k Da,p H值为4~7,蛋白点的形状较规则;TCA-丙酮沉淀法分离出的蛋白点仅有350个,表明样品中蛋白质分离种类较少,高丰度蛋白质过度显现,低丰度蛋白质检出率大大降低。 相似文献
10.
为建立蓖麻种子蛋白质双向电泳优化体系,本研究以‘2129’品系蓖麻种子为试验材料,采用2-DE技术的方法,对其进行研究。结果表明:酚提取法比TCA/丙酮沉淀法更适宜提取蓖麻种子的总蛋白质;24 cm pH 3-10NL的干胶条比pH 4~7的干胶条更适宜应用在蓖麻种子的2-DE电泳中;对蛋白质样品进行除杂比不除杂得到的蛋白质图谱更加清晰,且横条纹和纵条纹都有所减少;蛋白质上样量为800μg时获得的蛋白质图谱最佳。本研究将为蓖麻种子蛋白质组学的研究提供基础数据和技术支持。 相似文献
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巴西橡胶树幼叶和成熟叶比较蛋白质组学初步研究 总被引：1，自引：1，他引：0
为研究不同发育时期橡胶树叶片的功能代谢及揭示天然橡胶胶乳的合成调控机制,本研究以巴西橡胶树古铜期幼嫩叶片（幼叶）和稳定期完全成熟叶片（成熟叶）为实验材料,提取蛋白并进行双向电泳分离,结果发现幼叶与成熟叶相比,蛋白表达图谱差异显著,鉴定出的已知蛋白中多数参与了碳代谢及蛋白的翻译后修饰功能。本研究建立了成熟的巴西橡胶树叶片比较蛋白质组学研究的技术体系,获得了高分辨率的叶片蛋白双向电泳参考图谱,鉴定出来的腈裂解酶A链,核酮糖1,5-二磷酸羧化酶和肌动蛋白等在幼叶和成熟叶片中的表达量不同,这些结果为进一步揭示天然橡胶合成调控机制提供了一定的技术支撑与实验数据,对天然橡胶合成机制的研究以及其它热带植物叶片的蛋白质组学研究具有一定的参考意义。 相似文献
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适用于蛋白质双向电泳的棉花胚性培养物蛋白质提取技术 总被引：4，自引：0，他引：4
以陆地棉品种Coker 201为材料，对与甲醇/醋酸铵丙酮沉淀结合的酚抽提法和裂解液配方进行了优化，建立了适用于蛋白质双向电泳体系的棉花胚性培养物蛋白质样品制备技术。对胚性培养物，通过添加PVPP研磨和丙酮、TCA/丙酮、甲醇/醋酸铵等有机溶剂的系列洗涤，然后再进行酚抽提，蛋白质质量得到显著改善，获得的2-DE图谱质量高、可分辨的蛋白质点数多。比较分析3种裂解液对蛋白质的溶解效果发现，在裂解液中混合采用7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲以及4% CHAPS是最有效的配方。 相似文献
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本研究以“大久保”桃（Prunus persica L.cv.Okubao）硬核后期（盛花后56 d）的果实为试材,固相pH梯度（IPG）双向电泳系统分离蛋白质,所得图谱在中果皮与内果皮中检测到蛋白质点的数量分别为1273±101和1292±115个,其中30个为内果皮相对于中果皮2倍（p<0.05）上调的点,35个为2倍（p<0.05）下调的点。有10个蛋白点仅在中果皮表达,18个蛋白点只在内果皮表达。 相似文献
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水稻籽粒蛋白双向电泳条件的优化及其蛋白组学方法的比较 总被引：2，自引：0，他引：2
探讨适用于籽粒蛋白组学研究的策略,对深入研究籽粒的发育过程具有重要的意义。本文对比了3种不同的蛋白提取方法,优化了双向电泳中自制管胶一向的等电聚焦条件和IPG干胶条一向的等电聚焦时间,以MALDI-TOF/MS、Western-blot和磷酸化蛋白组学3个重要的蛋白质组学研究方法对胶内蛋白质鉴定分析。结果表明,可溶性蛋白提取法最适用于籽粒蛋白组学的研究; 电泳条件优化后,得到了较优的2-DE图谱; 胶内蛋白点适用于质谱分析、蛋白表达量验证(Western-blot)及籽粒蛋白的磷酸化组学的研究。本研究为下一步在蛋白组水平上分析籽粒发育提供了技术支持。 相似文献
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橡胶树C-乳清三种蛋白提取方法双向凝胶电泳分析 总被引：2，自引：1，他引：1
摘要：C-乳清是胶乳的主要组分,就双向凝胶电泳技术而言,目前仍无有效的蛋白提取方法,这严重制约了双向凝胶电泳技术在橡胶树蛋白组分析上的应用。本文选取3种方法提取C-乳清蛋白,通过对蛋白产量和提取蛋白的双向凝胶电泳图谱分析系统评价3种方法。就蛋白产量而言,三氯乙酸/丙酮沉淀法产量最高（0.86 mg/ml C-乳清）,三氯乙酸沉淀法次之（0.72 mg/ml C-乳清）,酚提取法最低（0. 66 mg/ml C-乳清）。双向凝胶电泳图谱分析表明：酚提取法可检测到447个蛋白点,图谱背景较暗且横纵向纹理多;三氯乙酸沉淀法可检测到821个蛋白点,图谱背景居中;三氯乙酸/丙酮沉淀法可检测到1052个蛋白点,图谱背景清晰且基本无纹理。综上所述,三氯乙酸/丙酮沉淀法最适合C-乳清蛋白提取。本文首次系统评价C-乳清蛋白提取方法,必将推动橡胶树C-乳清蛋白研究发展。 相似文献
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为了优化玉米叶片双向凝胶电泳技术条件,通过比较3种总蛋白提取方法对玉米双向电泳结果的影响,并对蛋白质上样量、IEF等电聚焦条件及SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度等参数进行探索、优化;结果发现,与酚提取法和磷酸缓冲液法相比,采用改进的TCA/丙酮法提取总蛋白操作简单、方便,所得的2-DE图谱中蛋白质点数量多、背景清晰,是一种适用于提取玉米苗期叶片总蛋白的有效方法;同时筛选出:第一向IEF等电聚焦样品上样量为800μg,聚焦条件为20 000 V/h,在浓度为12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,能够在17 cm的IPG胶条上获得背景低、分辨率较高、重复性好的双向电泳图谱,该优化体系适用于玉米叶片蛋白质组双向电泳分离,对玉米蛋白质组学研究具有重要参考价值。 相似文献
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为了探索并建立刺参的体腔液蛋白双向电泳体系,实验对刺参体腔液的蛋白质制备方法、上样量、IPG 胶条的pH选择及等电聚焦程序进行了优化,并利用银染法进行染色。结果表明：改进的TCA-丙酮沉淀法增加了提取的蛋白量和纯度;采用8.5 cm,pH 4~6.5的IPG胶条,45 μg蛋白上样量,等电聚焦先设250 v电压,7 mA电流,聚焦时间30 min后,再将电压升至1000 v,聚焦时间3 h,能有效提高双向电泳(2-DE)图谱中蛋白点的分离度和分辨率。本实验可用于筛选刺参差异表达蛋白以及后续的刺参蛋白质组学研究。 相似文献
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为建立适合甜瓜(Cucumis melo L.)叶片蛋白质组分析的双向电泳体系(2-D),以甜瓜植物叶片为试验材料,比较了2种不同植物叶片蛋白的提取方法,并对双向电泳的2个重要的环节技术即聚焦参数和上样量进行了优化。结果表明：与Tirs-酚提取法相比,使用改良后的Mg/NP-40/PEG3350/TCA丙酮提取法提取叶片蛋白,经过SDS-PAGEF分析之后,所得的蛋白含量较高,Rubisco酶去除的较好,条带清晰。采用 pH 3~10,18 cm的IPG胶条进行双向电泳时,适当增加低电压聚焦时间,得到了较为清晰的2-D图谱。蛋白上样量为800 μg时,得到的蛋白点数最多,低峰度蛋白较为清晰。研究建立了适用于甜瓜叶片蛋白分析的双向电泳体系,得到了蛋白点数目多且分辨率高的双向电泳图谱。为下一步在蛋白组学水平上分析与甜瓜抗病、产量、性状等相关蛋白提供了技术支持。 相似文献
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2D-DIGE蛋白质组技术体系及其在植物研究中的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
蛋白质组技术是植物基因功能鉴定和分析的强有力工具.经典的双向电泳技术是蛋白质组研究的核心技术,但差异蛋白质组分析使其具有更大的挑战性,因此在蛋白质水平的基因表达的定量分析研究需要更高灵敏度和更宽动力线性范围的技术.双向差异凝胶电泳(two dimension difference gel electrophoresis,2D-DIGE)是一种新出现的荧光标记的定量蛋白质组学技术,比经典的2-DE具有更高的动力学范围和灵敏性.该方法通过引入内标使得多个样品在一块胶上分离,进而减少了实验条件不一致引起的误差.2D-DIGE结合质谱、生物信息学及高可信度的统计分析使得成功地定量、鉴定植物蛋白质成为可能.本文综述了2D-DIGE蛋白质组学的基本原理,实验方法,2D-DIGE蛋白质组的优缺点和可能解决的方法,以及该技术体系在植物研究中的应用. 相似文献