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1.
构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞系(LMH)中的表达情况,以探讨p15基因对病毒复制、免疫信号通路的影响。以真核表达质粒pCAGGS-p15为模板扩增p15全长基因,经双酶切后克隆到慢病毒载体plvx-IRES-ZsGreen1上,构建成plvx-p15-Flag慢病毒表达质粒,将该质粒与辅助质粒共转染293T细胞产生慢病毒,将细胞上清中的病毒感染LMH细胞,检测p15蛋白表达情况。慢病毒载体在293T细胞上包装完成后,病毒滴度为2.25×105 TU/mL。慢病毒感染LMH细胞,基因和蛋白水平检测结果表明,p15蛋白表达良好。表达ALV p15基因的慢病毒包装成功,并且能够感染鸡源LMH细胞。该载体的构建为进一步研究p15蛋白的生物学功能提供工具。 相似文献
2.
为构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白P27慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞LMH中的表达,试验以实验室前期构建的pcDNA3.1-p27为模板,扩增p27基因,克隆入pLVX-IRES-ZsGreen1载体,构建的重组质粒命名为pLVX-p27,与辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染至HEK293T细胞,包装获得表达p27基因的重组慢病毒。将慢病毒上清感染293T和LMH细胞,检测细胞中p27基因的转录水平和蛋白表达水平。结果显示:重组质粒pLVX-p27构建正确,收集的慢病毒上清滴度为9×104TU/mL;实时荧光定量PCR、Western blot和共聚焦荧光试验结果显示P27蛋白主要定位于胞浆,p27基因的RNA和蛋白表达量在感染后96 h内随着感染时间延长逐渐升高。研究表明:表达p27基因的慢病毒包装成功,并且能感染293T及禽源LMH细胞,为进一步研究P27的生物学功能提供了工具。 相似文献
3.
《中国畜牧杂志》2015,(3)
构建冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究CIRP功能提供基础工具。本研究从4℃冷处理8 h的SD大鼠睾丸组织中获得CIRP的cDNA序列测序后,将其克隆入LV5质粒中,经双酶切及测序鉴定;利用脂质体将鉴定的阳性重组LV5-cirp表达载体与pGag/Pol、pRev、pVSV-G 3个质粒共转染到HEK-293T细胞,72 h收获上清,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液梯度稀释后感染293T细胞,检测病毒滴度,以及采用Western blot方法验证基因表达情况。结果表明:经琼脂糖凝胶电泳鉴定、PCR鉴定、酶切及测序结果证明成功构建了LV5-cirp重组质粒,序列比对与设计序列符合率100%,并成功包装成慢病毒,病毒滴度为6.30×108TU/m L;将制备成功的CIRP慢病毒过表达载体感染293T细胞后,Western blot检测结果显示细胞中CIRP蛋白表达水平显著高于正常细胞以及慢病毒阴性对照组(P0.01)。本实验成功构建CIRP慢病毒过表达载体并完成了慢病毒包装及滴度的测定,为今后的研究提供了基础工具。 相似文献
4.
旨在构建牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达慢病毒载体，并将其感染牦牛卵泡颗粒细胞(granulosa cells, GCs),了解它对细胞凋亡的影响。本研究提取牦牛卵泡RNA,以RT-PCR技术扩增lncRNA ENSBGRT00000000387.1全长序列，而后构建其重组质粒，并以慢病毒包装系统(pVSVG:pMDL:pRev)包装后利用qPCR法测定在293T细胞上的感染滴度，再感染分离培养的牦牛GCs,以qPCR检测GCs中lncRNA ENSBGRT00000000387.1的表达水平，并以流式细胞仪检测GCs的凋亡率，以Western blot和qPCR分别检测促凋亡基因CASPASE3、BAX和抑凋亡基因BCL-2的mRNA和蛋白表达水平。结果显示，由牦牛卵泡中成功扩增出lncRNA ENSBGRT00000000387.1的全长2 566 bp序列，将其与LV-EF1a-EGFP-2A载体同源区的片段同源重组，经酶切鉴定及测序验证表明成功构建了重组质粒，将之经慢病毒包装系统包装和浓缩后，在293T细胞的感染效率达(75.77±0.850)%... 相似文献
5.
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《中国预防兽医学报》2015,(5)
为构建携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0基因的重组慢病毒质粒,并检测其在HEK-293T细胞中的表达,本研究通过合成BVDV E0基因序列(AJ133739.1),构建包含Ig K信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-Ig K-E0重组质粒和不含信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-E0重组质粒,将其采用PEI方法分别转染HEK-293T细胞包装慢病毒,并浓缩后测定滴度,收集转染后上清液进行western blot检测蛋白表达。通过酶切、PCR及测序鉴定表明E0基因正确整合至慢病毒载体中,western blot结果表明其能够在HEK-293T细胞中表达。本研究构建获得携带BVDV E0基因的重组慢病毒,为BVDV E0蛋白哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性研究奠定基础。 相似文献
7.
《中国预防兽医学报》2015,(6)
为建立稳定表达施马伦贝格病毒(SBV)核衣壳(N)蛋白的BHK-21细胞系,本研究在SBV-N蛋白编码基因的C端加入6个组氨酸(6×His)标签,将其克隆至慢病毒载体p LV-EGFP-C中构建重组慢病毒质粒p LV-EGFP-SBV-N,将其与慢病毒包装质粒p Helper1.0和p Helper2.0共转染HEK-293T细胞,包装表达SBV-N蛋白的慢病毒。将重组慢病毒在聚凝胺(Polybrene)的介导下感染BHK-21细胞,采用嘌呤霉素(Puromycin)法和细胞有限稀释法筛选出一株稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系,命名为BHK-21-EGFP-SBV-N。间接免疫荧光试验进一步表明,该细胞系能够被SBV抗体阳性动物血清和特异性单克隆抗体2C8识别。稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系的建立,为SBV血清学检测方法的建立提供材料。 相似文献
8.
9.
针对小鼠RAW264．7细胞IRGl基N设计4个RNA干扰靶位,筛选出最佳干扰序列构建shRNA慢病毒载体质粒并包装获得慢病毒颗粒,进而经嘌呤霉素筛选获得稳转细胞系,实现IRGl基因在RAW264．7细胞基因表达的沉默。并通过布鲁菌l6M株及M5株感染基因沉默细胞对IRGl基因在布鲁菌感染中的作用进行研究。结果表明,慢病毒介导的shRNA高效、稳定地沉默了IRGl基因的表达,布鲁菌侵染RAW264．7细胞后IRGl基因表达上调。未试验为1RG1基因及相美调控基因抗布鲁菌病作用研究奠定了基础。 相似文献
10.
《黑龙江畜牧兽医》2020,(14)
为了研究干扰素刺激基因Viperin对猪流行性腹泻病毒复制的影响,试验构建猪源Viperin基因的慢病毒表达载体,并进行慢病毒的包装和转导,对重组蛋白质进行Western-blot鉴定,同时研究过表达Viperin对PEDV感染的影响。结果表明:成功构建了猪Viperin基因的慢病毒表达载体,命名为pWPXL-Vip,且测序结果进一步表明Viperin基因被正确克隆。免疫荧光检测结果显示猪Viperin在Vero细胞质中表达。Western-blot结果显示在分子质量约75 ku处有1条特异性条带,Viperin在Vero细胞中正确表达。用PEDV感染稳定表达Viperin的Vero细胞,荧光定量PCR结果显示过表达Viperin能够提高病毒拷贝数。说明本试验成功构建了猪Viperin基因的慢病毒表达载体,且表达的Viperin蛋白能够促进PEDV复制。 相似文献
11.
构建过表达抗禽流感病毒(H5N1)M1蛋白入胞单分子抗体(TAT-ScFv-mFc)的慢病毒载体,筛选获得稳定表达TAT-ScFv-mFc的HEK293T稳转细胞株。PCR扩增目的基因,将其插入质粒pLVX-mCMV-ZsGreen1-Puro中,构建pLVX-TAT-ScFv-mFc-ZsGreen1-Puro慢病毒过表达质粒,对重组质粒进行慢病毒包装后使用转染试剂复合物转染HEK293T细胞系,并使用嘌呤霉素(Puro)筛选阳性表达细胞,经过扩大培养及裂解后,以ProteinG纯化目的蛋白并对蛋白纯品进行鉴定。Western blot检测结果显示,成功获得了稳定表达TAT-ScFv-mFc的HEK293T细胞株。ELISA、SDS-PAGE、BCA结果显示成功获得预期目的蛋白2 mL(0.39 g/L)。结果表明,本研究成功建立了稳定表达抗H5N1病毒抗体的293T细胞系,为进一步研究TAT-ScFv-mFc的功能结构奠定了基础,也同时为真核表达系统的抗体制备研究提供了参考依据。 相似文献
12.
分别将靶向禽流感病毒(AIV)多靶点siRNA和鸡Mx基因克隆到p201慢病毒表达载体,采用鸡β-actin启动子替换p201慢病毒载体CMV启动子构建重组慢病毒载体p201-β-Mx-siRNA。并将其与辅助包装质粒共转染293T细胞,72h后收集细胞上清,实时荧光定量PCR测定重组慢病毒(rLV-MX-siR-NA)与对照组重组慢病毒(rLV-GFP)CT值,两者比较确定rLV-MX-siRNA滴度。rLV-Mx-siRNA以MOI=4感染猪胎儿成纤维细胞(PEF)并传代培养,提取后代细胞RNA检测外源基因转录以及应用间接免疫荧光试验检测鸡Mx蛋白的表达。结果表明,rLV-Mx-siRNA浓缩后滴度与已知滴度的rLV-GFP相等,为2×108 TU/mL,感染PEF效率>95%。感染rLV-Mx-siRNA的细胞传至第5代和第10代检测到外源基因转录以及鸡Mx蛋白的表达。表达鸡Mx基因和靶向AIV多靶点siRNA重组慢病毒滴度的测定与感染效率的分析,其结果为研究抗AIV转基因猪及其抗AIV的体外评价奠定了基础。 相似文献
13.
《黑龙江畜牧兽医》2020,(5)
为了制备牛布鲁氏杆菌外膜蛋白Omp22的抗原,试验采用PCR技术扩增Omp22基因;通过PCR和双酶切技术鉴定重组质粒pET28a(+)-Omp22;应用SDS-PAGE对重组质粒pET28a(+)-Omp22的表达进行鉴定;采用Western-blot方法对表达的重组蛋白Omp22与布鲁氏杆菌阳性血清的反应原性进行分析。结果表明:PCR扩增得到Omp22基因,其大小为639 bp,共编码213个氨基酸,并成功构建重组质粒pET28a(+)-Omp22;该重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中获得表达,表达的重组蛋白Omp22能与布鲁氏杆菌阳性血清发生特异性反应。说明重组蛋白Omp22具有良好的反应原性,为后续开发诊断抗体的试剂盒奠定了基础。 相似文献
14.
《中国动物传染病学报》2015,(2)
为了构建稳定表达兔岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase,FUT2)的RK13细胞系,本研究将FUT2基因编码序列插入到慢病毒载体p LOV-GFP-3Flag中,构建了p LOV-3Flag-FUT2重组质粒。将p LOV-3Flag-FUT2与包装质粒ps PAX2和外膜质粒p MD2.G共转染293T细胞,获得重组病毒样颗粒。用含病毒样颗粒的细胞培养上清液感染RK13细胞,并通过嘌呤霉素筛选、纯化,获得稳定表达FUT2的细胞系,命名为RK-FUT2细胞。连续培养10代后,利用PCR、RT-PCR和Western blot方法鉴定,结果表明,RK-FUT2细胞系能够稳定表达兔岩藻糖基转移酶。该细胞系为研究FUT2在兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)感染过程和致病机制中的作用提供了有力工具。 相似文献
15.
为了获得抗布鲁氏杆菌的特异性卵黄抗体,试验采用人工合成基因的方法获得含布鲁氏杆菌omp28基因的质粒,通过酶切、连接将目的基因与pET-32a载体进行连接,构建重组质粒pET-32aomp28,重组质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)后进行诱导表达,将得到的重组蛋白用Ni亲和柱纯化,然后用其免疫产蛋鸡,通过间接ELISA检测免疫抗体效价,并用Western-bolt验证抗体结合力。结果表明:布鲁氏杆菌omp28基因得到表达,并获得了抗布鲁氏杆菌OMP28的特异性卵黄抗体IgY,在五免后抗体效价可达1∶16 000,经Western-bolt验证有目的条带出现。说明获得的特异性抗体IgY与OMP28蛋白有较强的结合力。 相似文献
16.
研究结核分支杆菌Rv2031c基因对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分支杆菌Rv2031c的序列设计引物,以结核分支杆菌国际标准株H37Rv株灭活的菌液上清液为模版,扩增Rv2031c基因;克隆至慢病毒表达载体plex-EGFP中,经酶切和测序鉴定后,获得plex-Rv2031c-EGFP重组慢病毒载体;将重组慢病毒质粒分别与辅助质粒共转染至293T细胞中,转染48h后收集慢病毒,并侵染RAW264.7细胞;侵染48h时收集细胞,用流式细胞术检测各试验组巨噬细胞的凋亡率;提取细胞总RNA并反转录成cDNA,PCR检测Rv2031c基因在细胞中的表达情况;同时,使用细胞裂解液提取细胞总蛋白,Western blot检测Rv2031c蛋白表达水平。结果表明,成功构建了Rv2031c的慢病毒表达载体plex-Rv2031c-EGFP;构建了过表达Rv2031c的慢病毒Rv2031c-lv;感染Rv2031c-lv的RAW264.7细胞的凋亡率为41.8%,而对照组EGFP-lv感染的RAW264.7细胞其凋亡率为30.0%;PCR结果表明Rv2031c在Rv2031c-lv侵染的RAW264.7细胞中高表达;Western blot结果显示Rv2031c蛋白在Rv2031c-lv侵染的RAW264.7细胞中高表达。该研究成功构建了结核分支杆菌Rv2031c的慢病毒表达载体并验证了其对RAW264.7细胞凋亡的影响,为结核分支杆菌在机体内潜伏期感染的药物研究奠定了基础。 相似文献
17.
《中国动物传染病学报》2017,(4)
SAMHD1作为宿主的天然免疫限制性因子,参与机体的天然免疫调控,在机体抗病毒感染过程中发挥重要的作用。为了建立稳定表达猪SAMHD1的细胞系,本研究将猪SAMHD1全长编码基因克隆至慢病毒载体pWPXL,构建重组质粒pWPXLpSAMHD1。将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染MARC-145细胞,经嘌呤霉素筛选后,获得表达猪SAMHD1基因的MARC-pSAMHD1细胞系。经检测发现,该细胞系传至10代,仍能稳定表达猪SAMHD1蛋白。该细胞系的建立为猪SAMHD1抗病毒特性和猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理等研究奠定了坚实的基础。 相似文献
18.
猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。 相似文献
19.
针对绵羊Myostatin基因特异性序列,设计4对shRNA,并合成高表达载体。将干扰质粒和高表达载体瞬时共转染HEK293细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率,将筛选到最有效的shRNA表达载体和pDONR221载体进行BP重组反应,以获得含干扰序列的入门载体。然后将含干扰序列的入门载体和慢病毒表达的目的载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST进行LR重组反应,以获得含干扰序列的慢病毒表达载体。qPCR检测病毒物理滴度。结果本试验成功构建绵羊Myostatin基因RNAi慢病毒载体,病毒的滴度为：9.3×109 TU/mL。为研究Myostatin基因对肌肉生长的影响提供了稳定感染细胞载体。 相似文献
20.
旨在构建稳定表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)E165R蛋白的PK 15细胞系。ASFV E165R基因经PCR扩增连接到p3×FLAG-CMV-10载体，再由同源重组连接克隆到慢病毒载体得到重组质粒V2-FLAG-E165R。在HEK 293T细胞中进行慢病毒包装得到慢病毒颗粒并转导至PK 15细胞中，经嘌呤霉素初筛得到的多克隆细胞，接着以终点稀释法筛选获得稳定表达E165R蛋白的单克隆PK 15细胞系。通过PCR扩增、Western blot和间接免疫荧光鉴定构建的PK 15细胞系，进一步利用RT-qPCR技术检测NF-κB及炎症相关基因P65、IKBa、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平。结果表明，稳定过表达ASFV E165R蛋白的PK 15稳定细胞系构建成功，与对照细胞系相比，E165R蛋白显著增强NF-κB以及炎症相关基因IL-6、IL-8和TNF-α的基因表达。本结果为后续研究ASFV E165R对先天免疫信号通路的影响提供生物材料。 相似文献