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二重PCR方法鉴别气肿疽梭菌和腐败梭菌 总被引：1，自引：1，他引：0
用包含16S～23S rDNA间隔区和23S rDNA的部分序列作为气肿疽梭菌特异性标志,以α毒素部分序列作为腐败梭菌特异性标志,建立了鉴别气肿疽梭菌和腐败梭菌的二重PCR方法。结果显示：气肿疽梭菌C54-1株扩增出大小为509 bp的条带,腐败梭菌C55-1株、C55-16株均扩增出大小为148 bp的条带,均与预期吻合;而产气荚膜梭菌C57-1株、C59-37株,肉毒梭菌C62-4株,诺维梭菌C61-4株均未扩增出任何条带。扩增产物的测序结果进一步证实了本方法的特异性。菌株的生物学特性试验结果也符合相应气肿疽梭菌和腐败梭菌的特点。本研究所建立的二重PCR方法可用于气肿疽梭菌和腐败梭菌的快速鉴定。 相似文献
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为了构建气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)基因真核表达载体,探讨制备安全有效气肿疽核酸疫苗的可行性,试验根据NCBI上气肿疽CctA基因序列,通过Primer Premier 5.0设计了1对特异性引物用于基因扩增,将PCR扩增的CctA基因克隆至pMD19-T载体构建重组质粒pMD19-T-CctA,对测序正确的基因进行序列分析后亚克隆至pVAX-1真核表达载体,并对构建的pVAX1-CctA真核表达质粒进行PCR和双酶切鉴定。结果表明:成功扩增了CctA基因目的片段,并获得了与预期大小相符的重组质粒pMD19-T-CctA和真核表达质粒pVAX1-CctA。说明试验成功构建了气肿疽CctA基因真核表达载体。 相似文献
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建立一种快速鉴别诊断不同型产气荚膜梭菌的PCR检测方法,为动物产气荚膜梭菌病的快速诊断及流行病学调查提供有效的技术手段。克服传统鉴定方法耗时长、费用高的缺点,提高了检测效率。通过对产气荚膜梭菌α毒素、β毒素、ε毒素和ι毒素基因序列分析,利用Premier5.0软件设计并合成了5对特异性引物,建立了针对5种不同型产气荚膜梭菌的PCR鉴别诊断方法。通过反复试验确定了最佳退火温度为53℃。通过灵敏度试验表明,PCR检测方法最低能检测到的DNA浓度α毒素为308pg/μL,β毒素、ε毒素为30.8pg/μL,ι毒素A为0.122pg/μL,ι毒素B为0.05pg/μL。通过特异性试验表明,本方法具有较高的特异性。同时,通过对本方法检测出的阳性样品16S rRNA序列分析发现,与GenBank中的其他产气荚膜梭菌的16S rRNA序列同源性均在98%以上。表明建立的检测方法灵敏度高、特异性强,可以应用于动物产气荚膜梭菌病的实验室诊断。 相似文献
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气肿疽梭菌是一种严格厌氧的有芽孢的杆菌,可引起常见反刍家畜组织毒性缺氧,严重可致死,常为畜牧养殖业带来巨大的经济损失。气肿疽对反刍动物的影响存在已久,但其确切发病机制和相关毒力因子的作用仍未能被完全解读。随着研究的深入,已发现气肿疽梭菌的4种主要抗原和毒力因子在气肿疽发病过程中起着重要的作用。本文主要对气肿疽梭菌的4种主要抗原和毒力因子(细胞毒素A、鞭毛蛋白、神经氨酸酶和透明质酸酶)的相关研究进行总结概述,期望能为日后气肿疽检测方法和新型疫苗的研究提供参考。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(8):1523-1527
根据GenBank中已发布的产气荚膜梭菌α,β,ε,ι毒素基因序列,设计并合成4对特异性引物,经过优化多重PCR反应条件,建立了检测产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR方法。特异性试验表明,该方法对A,B,C,D,E型产气荚膜梭菌标准菌株均扩增出了相应的目的条带,而对诺维氏梭菌和腐败梭菌扩增为阴性;灵敏性试验表明,该方法对A,B,C,D,E型标准菌株基因组DNA最低检测量分别为9.0,17.8,12.2,13.8,18.5pg;重复性试验表明,该方法有很好的重复性。应用所建立的方法从21份羊临床病料中检测出9株A型和1株C型产气荚膜梭菌。本试验建立的多重PCR方法可以进行产气荚膜梭菌的快速检测及5种毒素型的鉴别。 相似文献
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《甘肃畜牧兽医》2020,(2)
为了解气肿疽梭菌(Clostridium chauvoei)细胞毒素CctA的生物学功能,参照GenBank中ATCC 10092株序列设计特异性引物,试验采用PCR技术扩增获得CctA基因。通过生物信息学分析软件DNAStar、EXPASY、Signal P、NetPhos Server V.3.1等程序,对CctA基因进行序列分析,并对其编码蛋白质的结构和功能进行预测。结果表明:CctA基因编码317个氨基酸;CctA基因编码蛋白质是一种偏酸性、稳定、亲水性蛋白,无跨膜区域,但存在信号肽,含有4个N-糖基化位点,1个O-糖基化位点,以及多个磷酸化位点,其中二级结构为混合型,无规卷曲最多,有22个优势的B细胞抗原表位。说明CctA基因是气肿疽梭菌的重要毒力因子,为预防黑腿病疫苗的候选抗原,本试验成功克隆CctA基因,并分析了其编码蛋白的特性,为进一步研究气肿疽梭菌CctA基因功能及其重组蛋白提供参考。 相似文献
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本研究旨在对吉林省延吉市三道湾镇两位农户饲养的病死黄牛进行快速诊断。本试验采集肝脏、脾脏、心脏、肌肉等组织,通过流行病学调查、临床剖检、显微镜观察、细菌培养观察、生化试验、分子生物学试验及动物试验进行气肿疽病诊断。病死黄牛的肌肉部位触压有捻发音,切面有大量血液和气泡流出,镜检可见两端钝圆、有芽孢的大杆菌,在肝片肉汤培养基中形成上清清朗、底部有松散的白色沉淀,生化试验均呈现气肿疽厌气菌所特有的产酸产气反应,PCR扩增出大小为501 bp的特异性条带。结果表明延边地区两病死黄牛感染了气肿疽病,证明了该地区气肿疽梭菌的存在。本试验首次分离鉴定出气肿疽梭菌延边株,为该地区气肿疽病的诊断和防制提供了重要的参考依据,同时为进一步研究该病的药物防制和免疫防制奠定了重要基础。 相似文献
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为利用TaqMan荧光定量PCR技术建立一种快速、敏感、特异的产气荚膜梭菌α毒素检测方法,根据产气荚膜梭菌各型之间共同的生物学特性,以编码产气荚膜梭菌α毒素的基因序列作为靶序列,设计1对引物和探针,分别以A、B、C、D 4个型的产气荚膜梭菌DNA为模板,通过优化引物、探针浓度和扩增条件,建立了TaqMan荧光定量PCR方法,同时对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行了验证。结果显示:当上下游引物浓度和探针浓度均为0.25μmol/L时,Ct值最低;该方法与大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等细菌均无交叉反应,具有良好的特异性;灵敏度高,对A型产气荚膜梭菌基因组DNA的最低检测限为9.1 pg/μL;重复性好,组内及组间试验标准差均小于0.4;对2023年收集的24份样品进行检测,发现本方法的阳性检出率(20.83%)与商品试剂盒一致。综上,本研究建立了一种快速、灵敏、稳定、特异的TaqMan荧光定量PCR方法,可对产气荚膜梭菌α毒素进行快速检测,为防控产气荚膜梭菌病提供了有力的技术支撑。 相似文献
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为了检测pcDNA3. 1-CctA质粒的免疫效果,试验将pcDNA3. 1-CctA质粒转染至Vero细胞,48 h后提取细胞蛋白进行Western-blot检测,正确表达气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)基因后用质粒免疫动物,检测特异性抗体免疫球蛋白G2a(IgG2a)、免疫球蛋白G1(IgG1)、白细胞介素-4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)的表达水平。结果表明:pcDNA3. 1-CctA质粒成功在Vero细胞中表达CctA蛋白;pcDNA3. 1-CctA质粒可有效刺激小鼠的体液免疫及细胞免疫应答,能在一定程度上提高机体的细胞免疫水平。 相似文献
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根据GenBank已公布的产气荚膜梭菌和腐败梭菌的α毒素基因序列,分别设计并合成针对2种α毒素基因的特异性引物,通过扩增条件的优化,建立快速鉴别产气荚膜梭菌和腐败梭菌的双重PCR方法。特异性试验显示,产气荚膜梭菌和腐败梭菌参考菌株均扩增出了相应的预期目的条带,而大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和链球菌则均未能扩增出相应条带。灵敏度试验结果显示,产气荚膜梭菌和腐败梭菌基因组DNA最低检测量分别为17.95pg/μL和1.261pg/μL。应用该方法对样品进行检测,其中5份为产气荚膜梭菌阳性。成功建立了特异性强、敏感性高的双重PCR方法,可以有效进行产气荚膜梭菌和腐败梭菌的快速鉴别,对羊梭菌病病原快速鉴定及流行病学调查具有重要意义。 相似文献
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应用聚合酶链反应诊断魏氏梭菌病 总被引：5，自引：1，他引：4
应用聚合酶链反应 (PCR)建立了一种诊断动物魏氏梭菌病的方法。试验根据已报道的浕毒素基因设计ＰＣＲ引物建立其诊断方法。该方法特异性强 ,仅可检测出魏氏梭菌 ;敏感性高 ,每克粪便可检出 2× 10 5个菌。初步应有结果表明 ,所建立的PCR诊断方法适合于人和动物魏氏梭菌病的临床诊断和流行病学调查 相似文献
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为快速检测厌氧菌引起的细菌性腹泻,建立一种产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、艰难梭菌(Clostridium difficile)和脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的多重PCR检测方法,本试验参照GenBank中产气荚膜梭菌Cpa基因序列、艰难梭菌Glud基因序列和脆弱拟杆菌Leu基因序列上设计合成了3对特异性引物(目的片段分别为326、750 bp和448 bp),通过对PCR反应条件的优化建立多重PCR检测方法。结果显示,多重PCR能从试验的产气荚膜梭菌、艰难梭菌、脆弱拟杆菌扩增出其目的条带,而其他细菌均不能扩增出目的条带;多重PCR对产气荚膜梭菌、艰难梭菌和脆弱拟杆菌的最低检出量分别为1.6×10-2、0.7pg/μL和2.8pg/μL。结果表明本试验建立的多重PCR方法具有良好的稳定性与特异性,为鉴别诊断这3种致病厌氧细菌所导致的腹泻提供一种快速、准确的检测方法。 相似文献
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根据羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型共有的α毒素基因,设计了1对引物,通过对PCR反应条件进行优化,建立了羊魏氏梭菌PCR检测方法。该方法扩增条带大小为255 bp,最低核酸检测量A型为0.39 ng/L、B型为0.62 ng/L、C型为0.52 ng/L、D型为0.87 ng/L、E型为0.92 ng/L,而对羊大肠杆菌、羊链球菌、金黄色葡萄球菌、羊多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。应用该PCR方法对54份临床样本进行检测,PCR检测结果高于细菌学和生化检测结果。结果表明,该PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床羊魏氏梭菌病的早期快速诊断。 相似文献
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产气荚膜梭菌是牛羊猝死和肠出血症的重要病原之一。本研究根据其常见的A、B、C、D四种菌型菌株编码α、β和ε毒素的保守序列,分别设计合成了针对这3种毒素的特异性引物,建立了多重PCR检测不同血清型产气荚膜梭菌的技术方法。通过对参考菌株的分型检测表明,该方法不仅快速、客观,而且具有良好的特异性和敏感性。对羔羊猝死症中分出的菌株进行检测,确定其为产气荚膜梭菌A型和D型混合感染;对产后母牛血痢病料中分离的菌株进行检测确定其为产气荚膜梭菌A型。 相似文献
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试验旨在对宁夏一绵羊场疑似大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的死亡病例进行确诊并提出相应的防治方案。采用产气荚膜梭菌显色培养基及伊红美蓝固体培养基进行病原分离培养,对分离菌株进行16S rRNA基因序列PCR检测,依据16S rRNA序列构建分离株分子进化树;之后对大肠杆菌分离株毒素因子进行PCR检测,对产气荚膜梭菌分离株进行毒素分型鉴定。结果显示,分离株PCR检测获得了16S rRNA特异性条带;分子进化树结果显示,大肠杆菌分离菌株NXDC001与大肠杆菌在同一分支,产气荚膜梭菌分离菌株NXSJ001与产气荚膜梭菌在同一分支。大肠杆菌分离株检测出毒素因子HPI (irp2)及LEE (eae);产气荚膜梭菌分离株携带毒素因子cpa,证明分离株为A型产气荚膜梭菌。研究表明,试验成功分离鉴定大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌各一株,证明病死羊为大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌混合感染。 相似文献
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建立了多重PCR检测产气荚膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因的方法。该方法具有良好的特异性和敏感性,只有产气荚膜梭菌呈现阳性,被检验的其他梭菌以及大肠杆菌、葡萄球菌均为阴性;将肉汤菌液样品10倍系列稀释后进行检测,检测灵敏度达到1.2×104CFU/mL。收集40份牛粪便样品,进行PCR检测,32份样品中成功扩增出589 bp的α毒素基因片段,阳性率为80%。结果显示,建立的多重PCR检测方法可取代血清中和试验,用于产气荚膜梭菌分型,同时表明A型产气荚膜梭菌在当地奶牛场中较为普遍。 相似文献
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《中国兽医杂志》2018,(10)
从送检羊病料中分离到不同产毒能力的11株疑似产气荚膜梭菌菌株,对分离株进行了形态、菌落特性及产毒能力的观察、分析,并通过血清中和试验,胰酶消化试验进行了血清型鉴定;参照Gen Bank文库相关数据,自行设计了产气荚膜梭菌α,β,ε三种毒素的特异性引物,对其中两株产毒性能良好(1000 MLD/m L),溶血特性明显的菌株利用多重PCR进行分型鉴定,分离菌株海F、海H及标准株(721株)均扩增出大小为325 bp的α毒素条带及236 bp的β毒素条带,无ε毒素,结合实验室诊断及多重PCR鉴别诊断结果,确定此次疫情为C型产气荚膜梭菌引起的羊猝狙。本试验的研究为羊猝狙的快速诊断、流行病学调查提供了科学依据,为建立产气荚膜梭菌多重PCR鉴定诊断方法奠定了基础。 相似文献
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姚文凤 《广东畜牧兽医科技》2016,(2):16-18
牛气肿疽梭菌病是一种由气肿疽梭菌引起的牛急性败血性传染病。报道了在粤东地区某村散养牛只发生的一例牛气肿疽梭菌病的诊治,通过观察临床症状及解剖病变,进行组织器官病理学切片、细菌分离、病毒PCR检测和毒理学检测,确诊为牛气肿疽梭菌病。 相似文献
20.
《中国兽医学报》2020,(5)
建立快速检测产气荚膜梭菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。针对GenBank发布的产气荚膜梭菌α毒素基因序列,应用Primer explorer V5软件在线设计了LAMP引物。通过对扩增条件包括反应时间、反应温度、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、内外引物浓度比、Bst DNA聚合酶浓度进行优化,建立了产气荚膜梭菌LAMP检测方法。特异性试验显示除产气荚膜梭菌外其他细菌检测结果均为阴性,灵敏度试验显示LAMP方法对该菌DNA最低检测量为10 ng/L,菌液的最低检出量为3.7×10~1 CFU/mL,分别是PCR方法的100倍和10倍。用建立的LAMP方法对牛粪便、饲料和饮水共计102份样品进行检测,产气荚膜梭菌阳性率为19.61%(20/102),与PCR检测及细菌分离鉴定结果一致,且样品增菌时间缩短2～4 h。本试验成功建立了快速、灵敏、特异、操作简便和结果可视的产气荚膜梭菌的LAMP检测方法。 相似文献