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1.
【目的】克隆苹果（Malus×domestica Borkh.）多个代谢途径中的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK）基因MdPCKs,研究其在不同组织器官及不同胁迫处理条件下的表达特性,为解析该基因在多个代谢途径中的功能奠定基础。【方法】利用同源比对和RT-PCR技术,克隆获得MdPCK1和MdPCK2全长cDNA序列并进行生物信息学分析;克隆MdPCKs的启动子序列,利用PlantCARE软件在线分析启动子上的顺式作用元件;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测MdPCKs在不同组织中的表达以及在水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）、模拟干旱（PEG）、高温（40℃）和低温（8℃）处理条件下的表达特性。【结果】获得2个苹果磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因（MdPCK1和MdPCK2;GenBank登录号分别为KT454964和KT454965）,其开放阅读框（open reading frame,ORF）分别为2 001 bp和2 028 bp,分别编码666和675个氨基酸残基;基因结构和进化分析表明,MdPCK1和MdPCK2均由12个外显子组成,且序列结构进化高度保守;氨基酸序列和结构分析显示,二者均含有保守的PEPCK ATP domain区域;启动子分析显示,MdPCK1和MdPCK2启动子区域含有多个顺式作用元件,包括光响应元件、昼夜节律相关顺式作用元件、JA响应元件、SA响应元件、ABA响应元件、防御及逆境响应元件、低温响应元件和热激响应元件等;qRT-PCR结果显示,MdPCKs在被检测的组织中均有表达。在‘泰山嘎啦’苹果果实不同发育阶段,MdPCK1和MdPCK2具有相似的表达模式。在多种非生物胁迫处理下,MdPCK1受到100 μmol·L-1 ABA和100 g·L-1 PEG胁迫诱导;MdPCK2受到150 μmol·L-1 SA、100 μmol·L-1 ABA、100 g·L-1 PEG和低温胁迫诱导。【结论】MdPCK1和MdPCK2属于植物PEPCK家族,非生物逆境胁迫可诱导MdPCK1和MdPCK2表达。 相似文献
2.
【目的】克隆甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPK1家族,分析3个物种MAPK1转录表达器官特异性。【方法】在电子克隆的基础上,利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术获得3个物种MAPK1全长cDNA序列和gDNA序列。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析3个物种MAPK1家族的器官特异性表达特征。【结果】从甘蓝型油菜、甘蓝和白菜中克隆了MAPK1家族共4个成员基因BnMAPK1-1、BnMAPK1-2、BoMAPK1和BrMAPK1,它们的gDNA长度为2 512—2 525 bp,均有3个外显子和2个内含子,最长标准mRNA为1 599—1 620 bp,ORF均为1 100 bp。系统进化分析表明,甘蓝型油菜MAPK1家族来自于甘蓝和白菜MAPK1之和,其中,BnMAPK1-1对应于BoMAPK1,BnMAPK1-2则对应于BrMAPK1。qRT-PCR结果显示3个物种MAPK1在所有检测器官中均有表达,但器官特异性在种间差异显著,暗示快速进化。【结论】克隆了甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPK1的全长cDNA序列和gDNA序列,支持甘蓝和白菜通过天然种间杂交形成异源四倍体物种甘蓝型油菜的假说,芸薹属MAPK1基因和蛋白在序列和结构上非常保守,但转录表达的器官特异性上进化极快,近缘种间差异显著。 相似文献
3.
利用RNA-Seq鉴定甘蓝型油菜叶片干旱胁迫应答基因 总被引：6，自引：2，他引：4
【目的】利用RNA Sequencing（RNA-Seq）技术比较2种不同生长条件下甘蓝型油菜苗期叶片转录组,鉴定油菜叶片干旱胁迫应答相关基因,从转录组水平揭示油菜适应干旱胁迫环境的分子机制。【方法】提取正常生长（ZY）和自然失水处理（ZY8D）的六叶期甘蓝型油菜中油821的叶片总RNA,以Illumina Hiseq 2000平台进行RNA-Seq分析。利用NGSQCTookit v2.3.3去除低质量和包含模糊碱基的reads。以甘蓝型油菜亲本物种白菜染色体v1.5和甘蓝Scaffold v1.0为参考序列,采用TopHat2-Cufflinks-Cuffmerge-Cuffdiff标准流程进行差异表达基因（differential expressed genes,DEGs）筛选。对上调和下调DEGs分别采用Cytoscape v3.1.0中的BiNGO和KOBAS2.0进行基因本体（gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）代谢途径富集分析。选择上调和下调DEGs各3个,以实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）验证RNA-Seq结果的可靠性。【结果】过滤低质量reads后,ZY和ZY8D分别保留了26 192 312和28 378 899对高质量reads用于DEGs筛选,其中86.6%和85.8%的reads能准确比对到参考序列上,说明RNA-Seq结果和参考序列可靠。DEGs鉴定结果表明3 657个基因受干旱胁迫诱导差异表达,其中上调表达基因1 431个,下调表达基因2 226个。GO富集分析发现上调表达基因主要与非生物胁迫响应和化学刺激响应相关,其中,参与水分胁迫响应和脱落酸（abscisic acid,ABA）刺激响应的基因分别有127和141个,而下调表达基因与植物病原菌防御、蛋白激酶活性和水杨酸（salicylic acid,SA）刺激相关。KEGG富集分析表明上调表达基因主要富集于苯丙烷和类胡萝卜素的生物合成及淀粉与蔗糖代谢途径,而下调表达基因主要富集于植物-病原菌互作和植物激素ABA、SA和茉莉酸（jasmonic acid,JA）信号转导途径。qRT-PCR检测6个DEGs的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实了RNA-Seq结果的可靠性。【结论】RNA-Seq分析鉴定出3 657个甘蓝型油菜叶片干旱胁迫应答基因。GO和KEGG代谢途径分析明确了差异表达基因富集的分子功能与代谢途径。 相似文献
4.
为了研究杨树ABF2同源基因的表达规律,从毛果杨基因组DNA中克隆出Pt AREB1基因上游一段1 800 bp序列。序列分析结果表明,该序列含有逆境胁迫响应元件TC-rich repeats、ABA应答元件ABRE和茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,Me JA)应答元件TGACG-motif等胁迫相关元件。在序列分析的基础上,构建了Pt AREB1基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体,利用农杆菌介导的花粉管通道法获得转基因拟南芥。结果表明Pt AREB1启动子可以在干旱、ABA、盐、Me JA和SA胁迫下,驱动GUS基因在转基因拟南芥的根、茎和叶中表达。说明Pt AREB1基因可能与干旱、高盐等胁迫应答紧密相关。 相似文献
5.
【目的】克隆苹果（Malus domestica Borkh.）中抗苹果轮纹病相关的编码谷胱甘肽转移酶基因MdGSTU1,研究其在不同组织器官及不同逆境处理条件下的表达特性,为解析该基因的抗逆功能奠定基础。【方法】基于抗轮纹病相关的EST序列,通过在NCBI进行比对,得到一个谷胱甘肽转移酶（GST）基因相关的EST片段;然后在苹果基因组数据库中进行比对,获得该GST的编码框序列（coding sequence,CDS）,同时,设计RACE引物,克隆该基因的UTR序列;利用MEGA5.0软件对该GST蛋白与拟南芥GST家族蛋白成员进行系统进化树分析,使用DNAMAN软件对该蛋白的分子量、等电点等进行预测,并对其氨基酸序列进行分析;采用荧光定量PCR检测该基因在不同组织中的表达以及该基因在盐、模拟干旱和苹果斑点落叶病原菌处理条件下的表达特性;克隆该基因的启动子,利用PlantCARE软件在线分析该基因启动子上的顺式作用元件。【结果】进化树分析显示该GST与拟南芥中GST家族的U亚家族成员亲缘关系最近,故被命名为MdGSTU1;MdGSTU1的CDS为666 bp,编码221个氨基酸残基,其蛋白分子量为25.41 kDa,等电点为5.28;RACE结果显示该基因3'UTR区域为135 bp;蛋白序列及结构分析显示,其与拟南芥GST家族蛋白相同,该蛋白也包含保守的谷胱甘肽-S-转移酶的N端及C端结构域;PCR结果显示,MdGSTU1在根、茎、叶、花、果各组织中均有表达,但根中的表达水平最高,同时,该基因能够被150 mmol·L-1 NaCl和20%的PEG诱导表达,均在1 h时表达量达到最高值;另外,苹果斑点落叶病原菌也能诱导MdGSTU1的表达,表达量在病菌处理8 h时达到最大;启动子分析显示MdGSTU1启动子区域含有多个抗性相关的作用元件,其中包括ABA响应元件、厌氧响应元件、GA响应元件、SA响应元件、JA响应元件以及防御和逆境响应元件;此外,该启动子上还包含多个MYB转录因子结合位点。【结论】MdGSTU1属于植物tau亚家族（GSTU）成员,生物及非生物逆境胁迫均可诱导该基因的表达。 相似文献
6.
基于转录组分析苹果水杨酸特异响应基因MdWRKY40的启动子鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】探明水杨酸(SA)对苹果叶片基因转录调控的影响,鉴定SA信号途径及其调控基因,为研究SA介导的抗病分子机制提供理论依据。【方法】生长30 d的‘嘎啦’组培苗叶片用2 mmol·L-1水杨酸(SA)处理12 h,以CTRL(0.2%乙醇)处理作为对照,利用Illumina Hi Seq TM 2000进行转录组测序,通过综合的生物信息学分析(差异基因筛选、条件特异性分析、GO分类及KEGG富集分析等)筛选SA信号途径的调控基因。克隆受SA特异性诱导表达基因的启动子,利用苹果细胞原生质体转化技术,进行启动子活性鉴定,确定对SA进行特异性响应的核苷酸序列。【结果】CTRL和SA处理分别获得750 439 459 bp和751 596 153 bp的原始数据,分别有44.77%和43.88%与‘金冠’苹果基因组完全匹配。获得3 329个显著性差异基因,包括苯丙烷类、类黄酮等次生代谢物生物合成途径的相关基因(如木质素合成关键酶CAD、细胞色素P450、真菌抗性相关的β-1,3-葡聚糖酶等),调控植物病原菌互作途径重要功能基因(钙调蛋白Ca M、抗病蛋白RPM1、热激蛋白HSP90、WRKY转录因子等)以及33个条件特异性诱导表达基因(NAC转录因子、NIMIN1、WRKY40、ERF转录因子等)。其中1 085个基因上调,2 244个基因下调。差异基因主要涉及细胞过程、代谢过程和基因绑定、催化活性等;根据转录组学的结果,将SA响应基因Md WRKY40的启动子序列克隆到含有荧光素酶基因的表达载体中,置于荧光素酶基因的上游,转化苹果原生质体细胞。SA处理的原生质体细胞,荧光素酶的活性为未经SA处理的20.6倍,而脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、1-氨基环丙烷羧酸(ACC)对荧光素酶的活性没有影响,说明该启动子为苹果中对SA进行特异性响应的启动子序列。不同区段的启动子片段对SA响应能力不同,从Md WRKY40翻译起始位点ATG向上游500—1 000 bp只能响应高浓度SA,而对低浓度SA不具有响应能力,1 500 bp片段对高浓度SA响应能力进一步显著增强,对低浓度SA响应也有微弱提高;而长度为2 000 bp的核苷酸片段无论对高浓度SA还是对低浓度SA都具有显著响应能力,且达到最强。与2 000 bp片段相比,2 500 bp的核苷酸片段没有进一步增强启动子片段对SA的响应能力。超表达Md WRKY40蛋白对其自身的转录具有抑制作用。【结论】2 mmol·L-1 SA处理所影响的基因主要参与了苯丙烷类、类黄酮的生物合成,植物病原菌互作及植物激素信号转导途径。位于Md WRKY40开放阅读框上游的2 500 bp核苷酸序列,为对SA进行特异性响应的核苷酸启动子序列。在1 000—1 500 bp及1 500—2 000 bp具有显著提高启动子对SA敏感性的未知核苷酸序列,另外,Md WRKY40转录调控存在反馈抑制机制。 相似文献
7.
【目的】克隆甘蔗乙烯受体Sc-ERS基因启动子序列,分析Sc-ERS基因启动子序列的作用元件。【方法】采用基于热不对称交错式PCR原理的染色体步移技术,从甘蔗ROC22基因组DNA中克隆Sc-ERS基因启动子序列,利用启动子预测软件PlantCARE和PLACE在线工具对Sc-ERS启动子序列的作用元件进行预测。【结果】克隆获得Sc-ERS启动子序列1410 bp, 该序列与玉米ERS25、ERS14核苷酸同源性分别为82%和80%。PlantCARE 在线分析结果表明,该序列具有启动子基本作用元件TATA-BOX和CAAT-BOX,还含有参与光响应元件、干旱诱导MYB 结合位点、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件、胚乳表达顺式调控元件、热胁迫响应元件等。【结论】从甘蔗基因组DNA中克隆获得乙烯受体Sc-ERS基因上游1410 bp的启动子序列,该序列含有多个特异性调控元件,推测Sc-ERS基因的表达可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素调控。 相似文献
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【目的】克隆甘蔗乙烯受体Sc-ERS基因启动子序列,分析Sc-ERS基因启动子序列的作用元件。【方法】采用基于热不对称交错式PCR原理的染色体步移技术,从甘蔗ROC22基因组DNA中克隆Sc-ERS基因启动子序列,利用启动子预测软件PlantCARE和PLACE在线工具对Se-ERS启动子序列的作用元件进行预测。【结果】克隆获得sc．ERS启动子序列1410bp,该序列与玉米ERS25、ERS14核苷酸同源性分别为82％和80％。PlantCARE在线分析结果表明,该序列具有启动子基本作用元件TATA．BOX和CAAT—BOX,还含有参与光响应元件、干旱诱导MYB结合位点、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件、胚乳表达顺式调控元件、热胁迫响应元件等。【结论】从甘蔗基因组DNA中克隆获得乙烯受体Sc-ERS基因上游1410bp的启动子序列,该序列含有多个特异性调控元件,推测sc．ERS;~因的表达可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素调控。 相似文献
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【目的】克隆山葡萄乙烯响应因子基因VaERF095及其启动子序列,分析在低温和外源激素诱导下该基因的表达模式和启动子活性,为深入探究VaERF095基因参与低温胁迫响应机理提供理论依据。【方法】采用同源克隆方法从山葡萄品种左山-1中获得VaERF095基因及其启动子,并通过实时荧光定量PCR检测VaERF095基因在低温（4℃）胁迫和外源激素诱导下及不同组织中的表达情况。同时构建VaERF095基因启动子融合GUS蛋白表达载体,瞬时转化葡萄叶片,通过β-葡萄糖苷酸酶（GUS）活性定量分析VaERF095基因启动子受低温胁迫和外源激素诱导的表达情况。【结果】从山葡萄克隆获得VaERF095基因,编码区（CDS）全长393 bp,编码130个氨基酸残基,该蛋白含有1个保守的AP2/ERF结构域,与欧洲葡萄和河岸葡萄的亲缘关系较近,氨基酸序列相似性分别为100.00%和93.08%。Va ERF095基因可响应低温和外源激素乙烯（ET）、水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和脱落酸（ABA）的诱导,呈现出不同的表达模式。VaERF095基因在老叶、茎、花序、卷须和果实均有表达,其中在卷须中... 相似文献
10.
【 目 的】 分 析 水 稻（Oryza sativa） 小 分 子 热 激 蛋 白（Small heat shock protein，sHSP） 基 因Os02g0782500 对逆境胁迫和激素的响应模式，为进一步研究 Os02g0782500 在逆境胁迫和激素响应过程中的功能提供理论依据。【方法】在水稻‘中花 11’中克隆获得 Os02g0782500，并对其进行生物信息学分析；同时利用定量 PCR（qRT-PCR）技术分析 Os02g0782500 在水稻不同组织及不同激素和非生物胁迫处理下的表达模式。【结果】Os02g0782500 编码区全长为 519 bp，编码一个含有 HSP20 保守结构域的 sHSP。系统进化分析显示，Os02g0782500 与玉米等单子叶植物中的同源蛋白亲缘关系较近。顺式作用元件分析表明，Os02g0782500 的启动子区含有 28 个植物激素响应元件和 35 个环境胁迫响应元件。qRT-PCR 分析表明，Os02g0782500 在水稻叶片中的表达量最高；且 Os02g0782500 的表达受 6-BA、GA3、IAA、高温、低温、PEG6000 和 NaCl 的诱导，推测其在水稻非生物胁迫响应过程中具有重要作用。【结论】明确了 Os02g0782500 的表达受高温、低温、6-BA、GA3和 IAA 等外界因素调控，推测 Os02g0782500 可能通过 IAA 等激素信号转导途径参与水稻的非生物胁迫响应。 相似文献
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【目的】研究甘蓝型油菜中茉莉素受体复合体核心成员CORONATINE INSENSITIVE 1（COI1）蛋白的基因表达特性及生理调控功能。【方法】利用基因组数据分析甘蓝型油菜及其亲本种白菜和甘蓝基因组的COI1构成情况;使用定量和半定量RT-PCR扩增方法检测油菜COI1的组织特异性表达;克隆油菜COI1保守区片段,构建病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silenceing,VIGS）载体,以农杆菌侵染方法培育VIGS诱导COI1沉默的油菜植株,然后,用鉴定出的COI1沉默植株研究油菜COI1在育性调控及虫害抗性等方面的调控功能。【结果】基因组数据分析表明,甘蓝型油菜亲本种白菜和甘蓝共有7个高度同源的COI1,依序列同源性可分为4类：COI1a、COI1b.1、COI1b.2和COI1c;甘蓝型油菜有8个COI1,也由上述几类同源基因组成。半定量和定量RT-PCR扩增试验表明甘蓝型油菜COI1在茎中的表达水平最低。从培育的VIGS诱导COI1沉默油菜中,共鉴定出COI1表达水平被抑制超过70%的株系25个,其中抑制效果最明显的10个株系被用于育性调控及蚜虫抗性试验。育性分析结果证明,VIGS沉默COI1油菜的结实能力受到严重影响,其角果在授粉20 d以后的长度只达到对照油菜角果授粉5 d后的长度,且角果中无正常种子;沉默COI1油菜的雄蕊长度短于相同花期的对照油菜雄蕊,其花药开裂延迟;显微观察发现,沉默COI1油菜的花粉中有超过80%呈不正常形态。在相同处理条件下进行的蚜虫抗性比较试验中,沉默COI1油菜叶片上的蚜虫数量超过对照油菜1倍多,而且有很多小蚜虫围绕大蚜虫的虫落,繁殖态势比对照油菜叶片上的蚜虫旺盛。【结论】甘蓝型油菜COI1具有组织特异表达特性,沉默COI1会导致油菜雄性不育性状发生,并降低油菜植株对蚜虫的抗性。 相似文献
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大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4启动子结构与活性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】克隆GmPAP4启动子(PAP4-pro),并分析其表达特性,为进一步研究其作用机制奠定基础。【方法】依据GmPAP4 c DNA序列(Gen Bank No.HQ162477),通过比对大豆参考基因组,设计特异引物,克隆GmPAP4启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测该启动子相关调控元件。构建GmPAP4启动子驱动GUS表达载体(PAP4-pro-GUS)并转化根癌农杆菌GV3101;通过Floral dip法将PAP4-pro-GUS转化拟南芥,利用卡那霉素(Kan)抗性筛选和特异引物的PCR鉴定,最终获得T3转基因拟南芥。通过对T_3转基因拟南芥不同组织GUS染色,分析启动子的组织表达特性,将T3转基因拟南芥通过适磷和植酸磷处理,20 d后,取其根部进行GUS活性和表达分析,研究启动子对不同磷环境的响应。【结果】克隆了GmPAP4上游启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测显示,GmPAP4启动子除含有启动子核心的调控元件外,还含有(1)组织特异调控元件:as1(根系特异表达调控元件)和Skn-1_motif(胚乳特异表达调控元件);(2)应答元件:TC-rich repeats(逆境胁迫反应调控元件)和Box-W3(真菌应答相关调控元件);(3)结合位点:MBS(MYB转录因子的结合位点)等。不同组织GUS染色结果显示,转基因拟南芥整个根系GUS染色较深,茎、叶中仅微管组织有较明显GUS染色,花瓣微管组织中也能观察到微弱GUS染色。定量PCR结果显示,植酸磷处理条件下转基因拟南芥根系GUS表达比适磷处理提高了1.3倍(P0.05);同时GUS活性测定显示,与适磷处理相比,植酸磷处理条件下转基因拟南芥根系GUS活性提高了1.9倍(P0.05)。【结论】获得大豆GmPAP4启动子,通过不同组织GUS染色和不同磷环境GUS表达分析显示该启动子主要在根部且受低磷信号诱导表达,为诱导型启动子。 相似文献
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马铃薯蛋白激酶基因StPK1启动子的克隆及活性分析 总被引：3，自引：2，他引：1
【目的】研究马铃薯蛋白激酶基因StPK1,为在马铃薯抗病反应中的功能提供证据。【方法】利用 TAIL-PCR技术,从马铃薯晚疫病水平抗性、垂直抗性和感病等3种材料中,分别克隆了该基因的启动子区域。此外,将从水平抗性材料中克隆得到的启动子与GUS连接构建植物表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化法转化本氏烟(Nicotiana benthamiana),将得到的转基因烟草分别用水、晚疫病原菌或水杨酸(SA)溶液处理,并进行表达活性分析。【结果】3个启动子长度分别为922、929和922 bp,均具有TATA-box和CAAT-box以及多种与抗病反应和基因时空表达有关的元件,而三者的主要差异是个别碱基的不同。GUS组织化学染色表明,用晚疫病原菌或SA处理的转基因烟草被染成蓝色。【结论】StPK1启动子为有活性的启动子,且为病原和SA诱导型启动子。 相似文献
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油菜基因BnWRI1的克隆及RNAi对种子含油量的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】阐明油菜基因BnWRI1对其种子含油量的影响。【方法】采用RT-PCR技术从油菜中克隆到BnWRI1基因编码区内384 bp的片段,将该片段正反向插入干扰载体pGΩ4ARi中,构建成RNAi表达载体pGΩ4ARi-WRI1,通过花粉管通道法将其转入油菜受体品种中双9号中,【结果】获得3棵转基因植株,PCR扩增和基因组Southern杂交证实外源片段已整合在受体油菜基因组中。利用半定量RT-PCR和改进的索氏提取法分别检测转基因T1代植株的BnWRI1基因表达量和种子含油量,结果表明：与非转基因对照相比,转基因植株的BnWRI1基因均受抑制,种子含油量有所降低。【结论】采用RNAi技术可使油菜内源基因BnWRI1沉默,表明油菜基因BnWRI1能有效调控种子含油量。 相似文献
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【目的】克隆万寿菊番茄红素β-环化酶基因和其启动子,进行生物学信息分析,并预测启动子功能,为万寿菊类胡萝卜素的代谢机制和叶黄素含量的调控提供参考依据。【方法】通过RT-PCR技术从万寿菊总RNA中克隆得到TeLCYb的cDNA序列;应用生物学方法分析其DNA序列及其编码蛋白质序列特征,使用DNAMAN和在线软件Box Shade对其氨基酸序列同源性比对分析,并利用MEGA6.0构建进化树,分析其亲缘关系;根据其cDNA序列利用FPNI-PCR法克隆其启动子序列,利用Plant Care在线数据库分析万寿菊TeLCYb启动子调控元件,构建启动子缺失表达载体pTeLCYb(-1969)∷GUS和pTeLCYb(-1140)∷GUS,利用农杆菌介导法侵染烟草,以GUS为报告基因研究不同调控元件的活性。【结果】从万寿菊中成功克隆TeLCYb,生物信息学分析发现,其全长共1 865 bp,开放阅读框为1 527 bp,编码508个氨基酸,氨基酸序列同源比对结果表明其与西洋蒲公英和菊花的同源性最高,且具有LCYb蛋白质特有的保守功能位点和特征多肽序列,在进化上与菊科单独聚为一枝。在已知基因序列的基础上获得长度为1 806 bp的TeLCYb启动子序列,生物学信息分析表明:该启动子除包含核心启动子元件TATA-box、CAAT-box外,还含有多种光应答元件和激素响应元件,其中光响应元件有13个,激素响应元件有5个,此外还具有MYBHv1结合位点元件、耐热响应元件、生理调控作用元件等顺式调控元件。GUS化学组织染色结果显示不同长度启动子均能够驱动GUS在茎、叶、花药及柱头中表达,但不同组织GUS染色蓝色斑点深度不同,其中花器官中花药和柱头中GUS酶活性最强;相对于启动子pTeLCYb(-1969),pTeLCYb(-1140)启动子还能够驱动GUS在根、叶和花萼中特异性表达,且各组织中GUS酶活性明显强于启动子pTeLCYb(-1969)的GUS化学组织染色结果。【结论】不同长度TeLCYb启动子均能驱动下游GUS的表达,但启动子的作用部位和作用强度存在差异,推测在ATG上游1 140 bp和164 bp区间的光响应元件可能具有增强子的功能,而全长启动子特有的激素响应元件和热响应元件可能具有抑制或降低启动子功能的作用。 相似文献
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[目的]研究毛白杨抗坏血酸过氧化物酶(APX)的基因启动子在转录调控中的作用,为进一步探讨抗坏血酸过氧化物酶启动子在植物抗逆中的应用奠定基础.[方法]依据毛白杨与毛果杨基因的高度同源性,以毛果杨LG-IX染色体上抗坏血酸过氧化物酶启动子序列为模板设计引物,从毛白杨总DNA中克隆一段启动子序列.[结果]克隆出的抗坏血酸过氧化物酶启动子序列长1234 bp,与毛果杨同源基因的同源性高达81.96%.该启动子包含多种可能与胁迫相关的顺式作用元件保守序列,这些顺式作用元件参与光调节转录、激素信号和植物防御信号的应答,PpAPX-IX基因在老叶叶肉和老叶叶脉中表达较多,老叶中表达较多,在新叶中表达较少;在生长旺盛的部分比如根和形成层表达量很低或不表达.[结论]该启动子能为组织特异性启动子,受多种逆境胁迫产生的化学信号的诱导在成熟细胞中特异性表达,可以构建该启动子连接PBI101的表达载体. 相似文献
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陆地棉开花相关基因GhFLP5的表达及功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】克隆陆地棉开花促进因子家族的一个基因Flowering Promoting Factor1-like Protein 5(Gh FLP5),并对其时空表达模式进行研究,解析其在开花调控过程中的作用,为创制早熟陆地棉材料奠定基础。【方法】根据NCBI数据库中的序列,用Oligo7软件设计引物,以中棉所50(CCRI50)的c DNA为模板,克隆获得Gh FLP5。在Ex PASy网站上预测其蛋白的理化性质,同时在NCBI中检索其他物种中的FPF蛋白,使用Clustal X2进行多重序列比对,并用MEGA6构建系统进化树;取陆地棉早熟品种CCRI50和中晚熟品种鲁棉研28(Lu28)不同生长时期、不同组织的样品,对Gh FLP5的时间和空间表达模式进行分析;从基因组数据库中调取Gh FLP5起始密码子上游1 500 bp的片段,用Plant CARE在线工具预测其顺式作用元件,选取相关激素对二叶期棉花幼苗进行叶面喷施处理,研究Gh FLP5的应答反应;构建植物表达载体p BI121-Gh FLP5,转化拟南芥,观察转基因株系的表型,并用q RT-PCR对其内源基因表达的变化进行测定。【结果】Gh FLP5开放阅读框长300 bp,编码的蛋白质分子量为11.4 k D,共包含3个比较保守的区域,与大豆、苜蓿和毛果杨的开花促进因子亲缘关系较近。空间表达模式分析表明,Gh FLP5在叶片中优势表达,且在早熟品种CCRI50中的表达量显著高于晚熟品种Lu28;时间表达模式分析表明,在CCRI50中其表达量高峰出现在三叶期,而在Lu28中四叶期表达量最高。Gh FLP5的启动子上主要存在两大类顺式作用元件,一类是光响应元件和生物钟元件,一类是胁迫响应元件。根据顺式作用元件的分布和功能选取水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)和茉莉酸(JA)喷施处理棉花幼苗,结果表明,Gh FLP5能响应外源SA和ABA而上调,也会被外施JA抑制。组成型表达Gh FLP5的拟南芥株系抽薹时间提前约9 d,开花时间提前约7 d,莲座叶数目减少,差异达到极显著水平。荧光定量的结果表明转基因拟南芥中促进开花的基因LEAFY(At LFY)、SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS(At SOC1)、FLOWERING LOCUS T(At FT)、APETALA1(At AP1)和FRUITFULL(At FUL)表达量显著升高,抑制开花的基因Flowering Locus C(At FLC)表达量显著降低。在转基因拟南芥中生长素应答基因SMALL AUXIN UPREGULATED 20(At SAUR20)和SMALL AUXIN UPREGULATED22(At SAUR22)显著上调,具有生物活性的赤霉素(GA)合成的相关基因GIBBERELLIN 20-OXIDASE 1(GA20OX1)的表达量提高2倍。【结论】转基因拟南芥早花表型明显,Gh FLP5可能在调控中发挥了双重作用,通过IAA和GA途径促进拟南芥的开花转型。 相似文献
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【目的】克隆甘蔗可溶性酸性转化酶基因（SoSAI1）全长cDNA序列和5?侧翼启动子序列,并分析其序列特征和基因表达模式。【方法】利用RACE技术克隆SoSAI1的全长cDNA序列,应用生物信息学软件分析SoSAI1预期编码蛋白特征;采用Genome Walking技术克隆SoSAI1的启动子序列;采用实时荧光定量PCR分析不同生长期SoSAI1在甘蔗叶和茎中的表达,以及PEG 6000、100 mmol•L-1 NaCl和6℃胁迫下,SoSAI1在甘蔗苗期根和叶中表达模式。【结果】SoSAI1的cDNA序列全长为2 387 bp,ORF长2 058 bp,编码685个氨基酸,预测其分子量和等电点分别为74.44 kD和5.6,GenBank登录号为JQ406875。5?侧翼启动子序列长417 bp,含有胚乳特异表达顺式作用元件和参与干旱诱导的MYB结合位点,GenBank登录号为KC862314。SoSAI1表达在生理成熟期的花序和花序轴中较高,而在成熟茎和老茎中较低。15%PEG和6℃能诱导叶中SoSAI1表达,而15%PEG和NaCl能诱导根中SoSAI1表达。【结论】获得SoSAI1全长cDNA序列和部分启动子序列,SoSAI1在甘蔗生长发育和蔗糖积累,并在应对环境胁迫中发挥作用。 相似文献