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1.
《江苏农业科学》2016,(10)
为构建新型H7亚型禽流感HA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。从NCBI数据库下载H7亚型禽流感HA全基因序列,合成HA基因;定向克隆到原核表达载体p ET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达质粒p ET-32a(+)-HA;转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot法鉴定。结果显示,重组质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确;重组的HA融合蛋白约为84 ku,大小与预期融合蛋白大小一致;重组HA融合蛋白可以与His标签单克隆抗体特异性结合,与H7阳性血清有较强的反应原性。成功构建了HA基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组HA融合蛋白表达。 相似文献
2.
《河北北方学院学报(自然科学版)》2017,(12)
目的构建微小脲原体核糖体蛋白L23基因原核表达载体并表达蛋白,为研究微小脲原体的生物学特性提供依据。方法根据NCBI上的微小脲原体核糖体蛋白L23基因序列设计引物,以微小脲原体基因组DNA为模板,通过PCR扩增目的基因后进行纯化,利用限制性内切酶BamH I和Not I对原核表达载体pGEX-6P-2和目的基因进行双酶切,并通过T4连接酶连接,连接产物转化XL1-Blue感受态细菌后接种至含氨苄青霉素的LB固体培养基培养,对形成的菌落进行PCR筛选和质粒测序验证,利用IPTG诱导表达GST融合蛋白,表达产物超声裂解后经GST Sepharose 4B纯化,SDS-PAGE电泳鉴定。结果经PCR成功克隆出目的基因,全长345bp,使用pGEX-6P-2质粒通用引物对转化有连接产物的大肠杆菌菌落进行PCR筛选鉴定,阳性菌落的PCR条带大小为468bp,与预期相符,对筛选出的菌落扩大培养并提取质粒进行基因测序,测序结果与NCBI中的基因序列完全一致,对诱导表达的重组蛋白进行SDS-PAGE鉴定,融合蛋白分子量质约为36.6kD,与预期一致。结论成功构建了微小脲原体核糖体蛋白L23原核表达载体,并在大肠杆菌中实现融合蛋白的表达,为微小脲原体核糖体蛋白L23基因以及解脲脲原体的后续研究奠定了基础。 相似文献
3.
为获得鸡VEGF基因片段,原核表达GST-cVEG基因,并对融合蛋白进行分离纯化,应用RT-PCR从鸡睾丸中扩增出VEGF片段,将PCR产物克隆至pMD 18-T载体.随后,将cVEGF片段亚克隆至带有GST的原核表达载体pGEX-4T-2中,测序鉴定.将重组质粒pGEX4T2-cVEGF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导,并进一步通过Ni-NTA Agarose亲合层析纯化,纯化产物以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,结果表明,成功地构建了原核表达质粒pGEX4T2-cVEGF.GST-cVEGF融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,Ni-NTA Agarose纯化后得到较纯的蛋白.Western blot分析证实,纯化后蛋白是GST-cVEGF融合蛋白,为进一步研究CST-cVEGF融合蛋白疫苗抗小鼠肿瘤模型奠定了基础. 相似文献
4.
中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因的原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
通过双酶切、连接转化等方法将中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(NT3GT)基因克隆到原核表达载体pET29a上,构建原核表达重组质粒pET29a-NT3GT。重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,NT3GT基因在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达的融合蛋白分子量约为55kDa。成功构建其原核表达载体并使其在大肠杆菌中得到高效表达,为NT3GT抗血清的制备及功能分析奠定基础。 相似文献
5.
为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a（+）构成重组子,经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达绿色荧光蛋白,经15% SDS PAGE鉴定,结果显示：重组质粒pET32a AcGFP1中的AcGFP1序列与Clontech公司的pIRES AcGFP1质粒的AcGFP1序列完全一致,表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因AcGFP1的原核表达质粒。此外,pET32a AcGFP1转化Rosetta（DE3）,经不同浓度的IPTG诱导,SDS PAGE检测均获得高效表达,为今后构建pET32a(+) TAT AcGFP1融合表达载体以及深入研究TAT的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。 相似文献
6.
为获得可溶性表达的兔NF-κB p50蛋白,本研究对兔p50基因进行大肠杆菌密码子优化及合成,并连接于原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌Origami B(DE3)菌株,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得GST-p50融合蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,GST-p50蛋白主要以可溶形式高效表达。经谷胱甘肽S转移酶(GST)磁珠纯化及蛋白免疫印迹(western blot)鉴定,所表达的GST-p50蛋白具有良好的反应原性。研究结果为进一步开展兔NF-κB互作蛋白及信号通路的研究奠定了基础。 相似文献
7.
目的:克隆布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因并构建原核表达系统.方法:用聚合酶链式反应技术扩增得到布鲁氏菌bp26基因片段,与PEASY-E1载体链接,转入BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后,经SDS-PAGE检测重组蛋白表达,用Western blot鉴定目的蛋白的生物活性.结果:DNA测序结果显示,重组质粒bp26基因的插入位点正确,成功构建了重组质粒PEASY-E1-bp26,经IPTG诱导,表达出大小为27kDa的bp26融合蛋白.结论:获得布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因片段,并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的bp26融合蛋白. 相似文献
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小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达，以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据GeneBank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物，以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板，经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接，转化TGⅠ大肠杆菌，筛选阳性克隆，其扩增片段测序结果与原序列一致，表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21（DE3）表达菌株中，经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定，并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达，主要以包涵体形式存在；融合蛋白的分子量为63 kD；以IPTG终浓度为0.8 mmol•L-1，诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达，为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。 相似文献
9.
斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。 相似文献
10.
为制备鼠抗鸭瘟病毒(DPV)UL6基因的多克隆抗体,采用PCR方法扩增出UL6基因,连接原核表达载体p ET-32a(+),构建表达质粒p ET-UL6,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃经1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况,将目的蛋白免疫Balb/c小鼠,利用ELISA方法检测特异性抗体效价。结果显示,构建的原核表达质粒经IPTG诱导能正确表达,且表达的重组蛋白能与DPV阳性血清反应,制备的多克隆抗体效价可达1∶16 000。表明,制备的多克隆抗体具有良好的免疫原性,可以用于UL6基因的表达检测。 相似文献
11.
对破伤风毒素C基因(TTC)进行了克隆,在大肠杆菌中构建了C基因-硫氧还蛋白融合表达系统并对其进行了重组表达,对表达后蛋白进行了纯化和rTTC的免疫原性初步研究。结果表明,该系统可高水平表达可溶性rTTC,rTTC表达量占可溶性蛋白的28.19%,纯化后纯度为96.92%;所获得的rTTC具有良好的免疫原性,可为开发新一代破伤风亚单位疫苗奠定基础。 相似文献
12.
猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
13.
[目的]研究NDV-HN蛋白抗原表位在动物免疫应答中的作用特点。[方法]根据HN基因和载体pGEX-4T-1的多克隆位点自行设计1对引物,以该实验室保存的重组质粒为模板,进行PCR扩增,再将其所得片段定向插入pGEX-4T-1,构建重组质粒,并对该重组质粒进行鉴定;再将构建的重组质粒在大肠杆菌中表达;最后,鉴定了相应单克隆抗体。[结果]PCR结果表明,得到了与预期结果一致的长度为850 bp的片段;重组质粒鉴定结果表明,成功构建了包含目的基因片段的重组表达质粒pGEX-4T-HN23;重组质粒经原核表达获得大小为57 kD的融合蛋白,免疫Balb/c小鼠试验表明,用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经ELISA筛选和3次亚克隆获得2株稳定传代（可传20代以上）和分泌抗NDV-HN抗体的杂交瘤细胞株。[结论]获得的鸡新城疫病毒HN单克隆抗体,为进一步研究HN在致病过程的作用及特异性诊断提供了重要试验材料。 相似文献
14.
[目的]制备人组织型纤溶酶原激活剂t-PA(1354-1802)抗血清,并测定其效价,为深入研究t-PA基因功能奠定基础。[方法]利用基因克隆技术获得t-PA(1354-1802)催化域基因片段,然后将其重组到pET-32a(+)质粒中,进行鉴定及序列分析;将测序正确的阳性质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导、蛋白纯化及免疫兔试验。[结果]SDS-PAGE结果显示,37 kD处出现特异性条带;对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备t-PA蛋白抗血清,Western blot分析表明,抗血清可与标准品t-PA蛋白特异性结合,间接ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶12 800。[结论]成功制备了t-PA(1354-1802)抗血清,为t-PA基因功能的深入研究奠定了基础。 相似文献
15.
[目的]构建传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF086基因的融合表达载体,制备抗体为进一步研究ORF086蛋白的免疫保护性提供前提条件。[方法]PCR扩增目的基因,构建重组质粒,经酶切鉴定,PCR和核酸序列分析后,IPTG诱导表达,Ni-柱纯化,注射新西兰白兔获得抗血清。[结果]扩增出ORF086基因,成功构建了重组质粒pET32a-ORF086,SDS-PAGE电泳和Western-blot分析显示,获得一条36.0 kD的融合蛋白。[结论]成功构建了原核表达载体,融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经柱层析纯化蛋白,纯度达90%以上。 相似文献
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根据已经发表的IN型水泡性口炎病毒(VSV)核蛋白(N)基因的序列设计1对特异引物,应用RT-PCR技术扩增编码IN VSV的N基因,将PCR产物按相应的阅读框架克隆到表达载体pET-32a。并将重组质粒转化入大肠杆菌 BL21株,以1．0 mmol·L-1 IPTG在37℃的条件下诱导,N基因得到了高效表达。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳以及用 VSV阳性血清进行Western blotting试验,结果表明所表达的融合蛋白产物分子质量与预期的65．3 ku相符。 相似文献
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【目的】明确鹅坦布苏病毒（GTUMV）E蛋白结构域I的原核表达及免疫原性,为进一步研究GTMUV E蛋白结构的生物学特性、免疫学功能等奠定基础。【方法】通过人工合成方法获得GTMUV E蛋白结构域I的编码基因（EI基因）,并与携带GST标签的p GEX-4t-1载体连接,转入大肠杆菌后经诱导表达获得融合蛋白,并以Western blotting鉴定融合蛋白是否有免疫原性。【结果】合成获得的E1基因片段为411 bp,将其插入p GEX-4t-1载体可构建重组表达质粒p GEX-4t-1-EI。阳性重组菌经1 mmol/L IPTG诱导5 h后,融合蛋白的表达量达最高峰,且以包涵体形式存在,分子量约41.0 k Da。Western blotting鉴定结果显示,融合蛋白与GST标签抗体和E蛋白阳性血清均可发生特异性反应,检测到预期的目的条带。【结论】GTMUV E蛋白结构域I可在大肠杆菌中成功诱导表达,且获得的融合蛋白具有良好的免疫原性,可用于GTMUV血清学检测试剂盒的研发。 相似文献
18.
根据GenBank发表的序列(L33180)设计引物,利用PCR技术扩增了编码家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)ORF75基因的DNA片段,将其连接至pMD18-T载体上,获得了该基因成熟蛋白阅读框序列.利用设计的酶切位点将目的基因从克隆载体上切下.表达质粒pGEX-4T-2经BamHI/XhoI双酶切,与目的片断连接,得到重组表达质粒pGEX/Bm75.将重组表达质粒pGEX/Bm75转化入大肠杆菌BL 21中,经IPTG诱导表达后,12%SDS-PAGE分析表明产生57 kDa左右的特异蛋白质条带.对表达产物进行Westernblotting分析,结果表明,pGEX/Bm75经IPTG诱导产生的57 kDa蛋白条带与抗体发生了很强的交叉反应,融合蛋白得到了表达. 相似文献
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[目的]为深入研究ITGB6亚基的基因功能奠定基础。[方法]利用基因克隆技术获得整合素β6基因（ITGB6）胞外区,然后将其重组到pET-32a（＋）质粒中,经鉴定及序列分析确定获得了重组阳性克隆;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导及蛋白纯化。[结果]SDS-PAGE结果显示,在94 kD处出现特异性条带;对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备ITGB6蛋白抗血清,Western-blot分析表明抗血清可与原核表达的ITGB6蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶2 560。[结论]成功表达了牛的重组整合素β6基因。 相似文献
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拟南芥ABI5相互作用蛋白AFP4(ABI five binding protein 4)是植物中的一个小分子蛋白,其表达特性与ABI5相似,受ABA诱导。以拟南芥Arabidopsis thaliana L. (Heyn) cv. Columbia为材料,通过PCR扩增了AFP4基因的完整编码序列。扩增片段插入到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点之间和酵母双杂交载体pGBKT7的多克隆位点EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点之间。将ABI5基因的编码序列插入到酵母双杂交载体pGADT7的多克隆位点EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点之间。重组质粒测序结果表明,所克隆的AFP4和ABI5编码区序列分别与NCBI数据库收录的AFP4基因(GenBank登录号NM_111081.2)和ABI5基因(GenBank登录号NM_129185.3)完全一致。重组原核表达载体含有AFP4片段的重组融合蛋白的理论分子量为53.4 ku。将重组质粒转化至大肠埃希菌表达菌株BL21 Star (DE3)中诱导表达,并经Ni-NTA亲和层析柱分离纯化、SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。将含有AFP4和ABI5的酵母双杂交重组质粒共同转化酿酒酵母AH109中进行酵母双杂交。结果表明,重组融合蛋白在大肠埃希菌E. coli BL21 Star (DE3)中表达的适宜条件为:IPTG浓度为0.4 mmol·L-1、25 ℃下诱导表达6 h。在上述条件下,重组融合蛋白占细胞破碎后上清液总蛋白的41.6%。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,AFP4融合蛋白在SDS-PAGE分析时呈现单一条带。该条带经过抗6xHis标签肽的抗体分析,呈阳性。该条带经酵母双杂交分析结果表明,AFP4和ABI5在酵母细胞中可以相互作用。 相似文献