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试验基于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L(P72)蛋白基因序列，建立一种高灵敏度和高特异性的检测方法。采用Oligo 7软件设计一步法巢式锁核酸荧光定量PCR(One Step NestedLocked Nucleic Acid real-time PCR,LNA-OSN-PCR)的嵌套引物以及探针，并对外引物进行锁核酸修饰。建立并优化LNA-OSN-PCR反应体系和条件，确立LNA-OSN-PCR标准曲线，并检验LNA-OSN-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。采用LNA-OSN-PCR方法，对96份临床疑似患病样品进行检测，同时与普通荧光探针PCR方法进行比较。试验确立并优化了LNA-OSN-PCR的反应条件和体系，建立的LNA-OSN-PCR标准曲线，具有较好的线性(R2=0.9945)。该方法的最低检测限为3×10-1copies/μL，变异系数小于3%，并且与其他病毒或细菌核酸无交叉反应。LNA-OSN-PCR方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法比较，检测灵敏度提高10～100... 相似文献
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SYBR Green I荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1 总被引：3，自引：0，他引：3
该研究旨在建立快速、敏感和特异的检测类猪圆环病毒因子 P1的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 法,用于 P1 的早期诊断.以感染 P1 的猪血清DNA提取物为模板,采用 PCR 扩增 P1 101 bp 的基因片段,将其克隆至 pMD18-T 载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立 SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测.经测序证实扩增片段属于 P1,所建立的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 的反应在 101 ～108拷贝/μL 之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10拷贝/μL,而对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测为阴性,表明该方法敏感、特异.成功建立了 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 载量的方法,为 P1 致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台. 相似文献
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根据犬瘟热病毒核蛋白基因的保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针建立荧光定量PCR。构建FQ-PCR绝对定量的标准品,并对反应体系进行优化, 建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果显示：实验成功构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.994。犬瘟热病毒FQ-PCR检测反应的灵敏度为10 TCID50;5种非犬瘟热病毒病原体检测均为阴性;说明本实验建立的FQ-PCR具有快速、灵敏和稳定的特点,适用于临床样品的检验。 相似文献
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荧光定量PCR技术在猪病毒病诊断上的应用 总被引：2，自引：1，他引：1
摘要：荧光定量PCR技术融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,以直接探测PCR过程中荧光信号的变化获得定量的结果。因其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点,为动物疫病诊断技术提供了新的模式,成为当前动物疫病检测广泛采用的分子生物学诊断技术。论文就实时荧光定量PCR技术在猪瘟、猪繁殖与呼吸综合症、猪圆环、猪流感等猪病毒病检测上的应用作一综述,以期为猪病毒病的防控提供参考。 相似文献
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为了建立一种便捷、快速且精准的非洲猪瘟病毒的检测方法,本研究根据GenBank中公布的ASFV p72基因序列,设计了一对特异性引物,并对引物中的适当碱基进行锁核酸修饰,通过优化退火温度、引物浓度,建立了非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物PCR检测方法。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,检测灵敏度可以达到3×101 copies/uL,比常规引物PCR方法的灵敏度提高了100倍,比real-time PCR方法的灵敏度提高了10倍,对猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒等病原基因组均无扩增,特异性良好。72份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。本研究成功建立了非洲猪瘟病毒的LNA引物PCR检测方法,方法的特异性强、敏感性高,操作简单,为非洲猪瘟病毒的检测提供了一种新的、更加敏感的检测技术。 相似文献
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CSFV,SIV,PCV2,PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用 总被引：1，自引：1，他引：0
参照GenBank中的猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)基因序列,设计了5对引物分别用于扩增CSFVE2、SIV、PCV2ORF2、PRVgB、PRRSVN基因的目的片段。通过对反应条件进行优化,建立了检测CSFV、SIV、PCV2、PRV和PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法。敏感性和特异性结果显示,该mPCR对5种病毒的最低核酸检测量为10pg。而对大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、猪细小病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒的多重PCR的扩增结果均为阴性。临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对SIV、CSFV、PCV2、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。 相似文献
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目前我国菠萝产区已相继报道3种菠萝凋萎相关病毒(PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3)。通过建立这3种菠萝凋萎相关病毒实时荧光定量RT-PCR(RT-q PCR)同步定量检测方法,为菠萝凋萎病毒的定性定量研究提供技术手段。根据这3种菠萝凋萎相关病毒的外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物和Taq Man水解探针,在优化PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-q PCR反应体系后,以PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3 CP基因目的片段的重组质粒为标准品绘制标准曲线,初步建立了PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-q PCR检测方法。其中PMWaV-1标准曲线为y=-3.283logx+39.02,其扩增效率达101.7%,线性相关系数R2=0.999;PMWaV-2标准曲线为y=-3.393logx+37.53,其扩增效率为97.1%,线性相关系数R2=0.998;PMWaV-3标准曲线为y=-3.171 logx+38.48,其扩增效率为106.7%,线性相关系数R2=0.996;这表明3种菠萝凋萎相关病毒质粒标准品在同一反应体系中可稳定扩增,且线性关系表现良好,可用于后续试验。灵敏度试验数据表明,该方法对PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的最低检测线分别为99,98,868拷贝;重复性试验表明PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-q PCR扩增曲线的标准差小于0.267,变异系数小于1.44%。这表明建立的三重RT-q PCR检测方法可快速、准确、稳定地定量检测PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3等3种病毒,为PMWaV的定性定量研究和复合侵染机制的探索提供了技术基础。 相似文献
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应用纳米磁珠实时荧光PCR检测非洲木薯花叶病毒 总被引：1，自引：1，他引：0
建立非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus, ACMV)灵敏快速的纳米磁珠实时荧光PCR检测技术,防止其传入中国。采用TaqMan探针结合纳米磁珠(magnetic nanoparticles, MNPs)技术,以外壳蛋白基因为目标基因,通过特异性及灵敏度试验建立MNP荧光PCR检测方法。成功建立了非洲木薯花叶病毒(ACMV)的MNP荧光PCR检测方法;该方法检测阈值约为13 pg DNA,比普通PCR及ELISA方法灵敏度高25倍;该方法具有良好的特异性,能够有效区分双生病毒属的ACMV、棉花曲叶病毒(CLCuV)、番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)及番茄严重曲叶病毒(ToSLCV)。MNP荧光PCR方法能够快速灵敏的检测茎叶样品中的ACMV,无需任何PCR后处理,交叉污染风险小,适于口岸检验检疫。 相似文献
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猪流行性腹泻病毒Real-time PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：1，他引：1
为定量检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）载量,建立PEDV的Real—timePCR方法。用RT-PCR方法扩增PEDV的M基因片段,构建含有M基因片段的重组质粒,用该重组质粒进行SYBRGreen I Real—timePCR,来建立检测PEDV的荧光定量PCR方法。结果显示：在（5．56×10^2-5．56×10^7）拷贝／皿范围内,所建立方法具有优良的线性关系,其决定系数为0．9996,扩增效率为99．5％,扩增产物的熔解曲线只有一个特异性峰,无引物二聚体峰,熔解温度为（81．18±0．21）℃。该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒II型等猪源病毒均检测不到扩增产物,重复性试验的变异系数小于3％,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明：建立的Real-timePCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏性高,可用于PEDV的定量检测及其早期感染的快速诊断。 相似文献
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TA克隆构建含MOC1基因cDNA片段的重组质粒,作为TaqMan定量检测水稻分蘖基因MOC1 mRNA的标准品,建立了检测方法。采用RT—PCR。的方法,从水稻分蘖芽总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增MOC1基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。对重组质粒进行实时荧光定量PCR实验。建立了MOC1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达10^2拷贝,线性范围为10^2-10^7拷贝,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r=0．999）,扩增效率高（E=92．8％）。成功建立了MOCI基因实时荧光PCR定量标准品,且TaqMan荧光定量RT—PCR的方法可对水稻分蘖基因MOC1 mRNA的表达进行准确定量。 相似文献
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猪圆环病毒2型和伪狂犬病弱毒疫苗体外共接种对猪外周血单个核细胞调节性细胞因子mRNA表达的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
为分析猪圆环病毒2型（PCV2）对伪狂犬病弱毒苗（PRV）免疫反应的影响,用real-time PCR技术检测了仔猪外周血单个核细胞（PBMC）体外单接种和共接种PCV2与PRV后调节性细胞因子IL-4、IL-10、IL-12p40及IFN-γ的mRNA表达水平。结果表明,PRV能引起IL-4、IL-12p40与IFN-γ的mRNA表达上调,PCV2能引起IL-4、IL-10与IL-12p40的mRNA表达上调;而且,PCV2能抑制PRV诱导IL-4、IL-12p40及IFN-γ的mRNA表达上调,其中对IFN-γ mRNA表达的抑制效果最为显著（P<0.05）,提示PCV2可能会对PRV的细胞免疫反应产生不利影响。 相似文献
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【研究目的】为了研究猪圆环病毒的分子生物学特征及其发病机理和致病机制,【研究方法】将疑似猪圆环病毒2型的猪脾脏、淋巴结用胰蛋白酶消化处理后接种PK-15细胞,盲传6代后,病毒已经适应PK-15细胞,【研究结果】然后设计一对特异性引物利用PCR技术扩增出ORF2片段中540 bp的基因。第6代细胞病毒液经间接免疫荧光检测表明,在荧光显微镜下可见PCV特征的荧光斑,表明毒株具有感染性。【结论】将病毒纯化后进行电镜观察,病毒粒子直径约17nm,圆形,无囊膜,研究结果表明分离的病毒为猪圆环病毒。 相似文献
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建立高效的目的基因检测方法是保障生物育种研发和产业化进程的重要技术支撑。应用常规PCR法、TaqMan探针实时荧光PCR法及叶片直接PCR法对转基因玉米叶片进行CaMV35S启动子和NOS终止子2个转基因元件的检测。结果表明,叶片直接PCR法分别较常规PCR方法和TaqMan探针实时荧光PCR法节约62%、48%的时间和25%、43%的成本,而且扩增出的目的条带清晰可见,符合目的片段大小,结果真实可靠,适用于大量转基因玉米植株叶片的快速筛选和鉴定。 相似文献
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转基因抗虫玉米的定量检测 总被引：1，自引：1，他引：0
建立高效、快速、准确的抗虫转基因玉米MIR162转化体特异性实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法。采用SYBR Green I和Taqman探针2种定量方法对抗虫转基因玉米MIR162进行了检测研究。SYBR Green I法MIR162转化体特异性片段和内标基因zSSIIb的熔解曲线均表现为单一峰,扩增特异性强;二者的扩增效率均在90%~100%之间,标准曲线相关系数R2均大于0.998。2种定量方法的检测限(LOD)均为24个拷贝,定量限(LOQ)为48个拷贝,灵敏度较高。重复测试结果表明,SYBR Green I法的标准偏差(SD)变化范围为0.05~0.13,相对标准偏差(RSD)范围为0.17%~0.40%,Taqman探针法的SD变化范围为0.03~0.14,RSD范围为0.11%~0.44%,说明2种定量检测方法具有良好的重复性和精密度。对MIR162含量为3%、1%和0.5%的混合样品的定量结果为：3.13%、1.09%、0.53%（SYBR Green I法）和3.07%、1.02%、0.50%（Taqman探针法）,RSD均小于10%,T检验分析表明2种定量方法定值结果差异不显著。本研究建立的2种实时荧光定量PCR均可有效对转基因玉米MIR162进行定量检测,可根据不同实际需求及实验室条件进行选择相应的检测方法。 相似文献
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应用纳米磁珠荧光PCR检测棉花曲叶病毒 总被引：1，自引：1，他引：0
为了提供快速灵敏检测棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl virus, CLCuV)的技术以防止其传播扩散,本研究根据CLCuV外壳蛋白基因（Coat protein, CP）保守序列设计了引物和TaqMan探针,并结合纳米磁珠(Magnetic nanoparticles, MNPs)建立了该病毒的MNP实时荧光PCR (Real-time PCR)检测方法。该方法检测阈值约为525 fg·μL-1 DNA。通过对CLCuV、非洲木薯花叶病毒、烟草线条病毒、黄瓜花叶病毒及番茄斑萎病毒的检测表明,该方法具有良好的特异性;同时该方法无需任何PCR后处理,交叉污染风险小。本方法可用于CLCuV的快速检测。 相似文献