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为了筛选出高表达棉花GhWRKY91可溶性蛋白的原核表达载体。以中棉所10号叶片的cDNA为模板PCR扩增GhWRKY91基因,扩增产物分别构建到4个不同的原核表达载体pET-22b(+)、pET-32a(+)、pMAL-c5x和pGEX-4T-1。将重组载体pET-22b(+)-GhWRKY91、pET-32a(+)-GhWRKY91、pMAL-c5x-GhWRKY91和pGEX-4T-1-GhWRKY91转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)或Arctic-Express?(DE3)RP中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析不同原核表达载体的蛋白表达情况。结果显示,pET-22b(+)-GhWRKY91 和pET-32a(+)-GhWRKY91在BL21(DE3)中以及pMAL-c5x-GhWRKY91在Arctic-Express?(DE3)RP中均未见明显蛋白表达,而pGEX-4T-1- GhWRKY91在Arctic-Express?(DE3)RP中表达的蛋白基本存在于上清中,可获得可溶性蛋白。因此,将GhWRKY91基因构建到pGEX-4T-1原核表达载体上可成功获得可溶性蛋白。 相似文献
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【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。 相似文献
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【目的】探明芥菜型油菜黄化突变体L638-y叶片氨基酸合成代谢网络变化。【方法】以芥菜型油菜黄化突变体L638-y及其野生型L638-g为材料,用氨基酸自动分析仪及实时定量PCR,检测并分析了幼苗叶片游离氨基酸含量及氨基酸合成代谢中8个重要基因的相对表达量。【结果】1) 芥菜型油菜黄化突变体L638-y幼苗叶片游离氨基酸总量低于野生型L638-g,被检测出的17种游离氨基酸中,有10种氨基酸含量低于野生型L638-g,而其他7种则高于野生型L638-g;各游离氨基酸的含量在突变体L638-y与野生型L638-y叶片之间变化幅度不尽相同,其中差异显著的是甘氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、精氨酸,谷氨酸的变化最小。2) 氨基酸合成代谢中8个重要基因表达量变化的分析结果表明,仅谷氨酸族氨基酸生物合成的谷氨酸合酶基因（GSR）的表达在L638-y中呈上调表达趋势,其余的7个基因,即谷氨酰胺合成酶基因(GLN)、天冬氨酸氨基转移酶基因(GOT)、天冬酰胺合成酶基因(ASN)、Δ′-二氢吡咯-5-羧酸还原酶基因(P5CR)、丙氨酸氨基转移酶基因(AAT)、3-磷酸甘油酸脱氢酶基因(PGDH)、ATP磷酸核糖转移酶基因（ATP-PRT）均下调表达。3) 在突变体L638-y叶片氨基酸合成代谢途径中,8个重要基因表达量的变化与相关游离氨基酸含量的变化并不一致,表明氨基酸合成代谢受到了抑制。【结论】芥菜型油菜黄化突变体L638-y幼苗叶片中氨基酸合成代谢和氮代谢受到了抑制。 相似文献
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OjCHS原核表达载体的构建及重组蛋白的纯化 总被引：1，自引：1，他引：0
查尔酮合酶（chalcone synthase,CHS）是类黄酮生物合成过程中的第一个关键酶,也是限速酶,它直接影响并限制类黄酮的合成与积累。在克隆得到日本蛇根草CHS基因（OjCHS）基础上,将该基因插入原核表达载体pET-28a,完成重组表达质粒pET28a-CHS的构建。随后,利用冻融法将上述质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞中用于重组蛋白的表达。选择不同IPTG 浓度、诱导温度及诱导时间对重组菌进行诱导,确定了可溶性重组蛋白的最佳诱导表达条件。最后,通过洗脱、纯化、透析与浓缩完成重组蛋白的纯化。结果显示,成功构建原核表达载体pET28a-CHS,可溶性重组蛋白最佳诱导条件为：IPTG 浓度0.45 mmol·L-1,25 ℃下诱导12 h。最后大量制备并纯化获得符合预期大小的可溶性蛋白,为深入研究OjCHS的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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为克隆犬弓首蛔虫Toxocara canis,T.canis卵黄原蛋白DUF1943结构域(The domain of unknown function1943,DUF1943)(Tc-duf1943),构建其原核表达载体pET-28a(+)/duf1943,并检测重组蛋白在大肠杆菌Escherichia coli,E.coli中的表达形式.该文根据T.canis的转录组数据,以T.canis雌、雄虫cDNA为模板扩增Tcduf1943,然后与表达载体pET-28a(+)连接,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,对目的蛋白的原核表达形式和蛋白质纯化进行鉴定.结果显示Tc-duf1943序列长度为864bp,含有一个完整的开放阅读框,编码288个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果表明,重组蛋白以包涵体形式存在,相对分子质量大小约为3.5×10~4;对表达条件进行优化后,以0.4mmol/L IPTG,于37℃诱导4h时可获得大量目的蛋白;利用Ni-NTA亲和层析柱纯化可以获得具有较高纯度的目的蛋白.该试验成功构建了pET-28a(+)/duf1943原核表达载体,为进一步研究TcDUF1943的生物学功能奠定了基础. 相似文献
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【目的】原核表达红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）卵黄蛋白原（Vg）VWD结构域,为深入开展Vg的生物学功能研究和开发相应的生物活性物质提供技术支持,也为改进虾类养殖催熟及获取高质量后代打下基础。【方法】在GenBank中搜索红螯螯虾卵Vg的mRNA序列（AF306784.1）及查找其VWD结构域（2345~2491 aa）,采用ExPASyProtParam、ProtScale、InterProscan及TMHMM等在线软件进行生物信息学分析及理论评估,结合大肠杆菌密码子偏好优化原始VWD氨基酸序列;然后通过全基因合成获得目的基因,连接至载体pET-28a构建重组质粒pET-28a-VWD,挑取阳性克隆转化大肠杆菌BL21（λDE3）感受态细胞及采用IPTG进行诱导表达,并以10% SDS-PAGE电泳和Western blotting检测诱导表达的融合蛋白。【结果】红螯螯虾VWD结构域相对分子量为19692.11 Da,理论等电点（pI）为9.35,分子式为C855H1334N258O261S9,属于不稳定的亲水性蛋白,不含跨膜结构域。延伸链和无规则卷曲是红螯螯虾VWD结构域二级结构的主要元件,其中,α-螺旋占7.73%,β-转角占10.50%,延伸链占35.91%,无规则卷曲占45.86%。重组质粒pET-28a-VWD经大肠杆菌BL21（λDE3）感受态细胞诱导表达即获得融合蛋白VWD,以2 mol/L盐酸胍溶解和Ni-NTA亲和层析纯化及复性后,10% SDS-PAGE电泳和Western blotting检测均在蛋白相对分子量约20.0 kD处出现1条清晰的特异性条带,融合蛋白VWD表达形式以包涵体为主。融合蛋白VWD在BL21（λDE3）感受态细胞中高效表达的最佳诱导条件:当单克隆菌液OD600 nm达0.6时添加0.5 mmol/L IPTG,置于20℃下诱导培养16 h。纯化后的融合蛋白VWD浓度为1.32 mg/mL。【结论】通过全基因合成获得的优化红螯螯虾VWD基因能在大肠杆菌BL21（λDE3）感受态细胞中诱导表达出以包涵体为主要形式的融合蛋白,经盐酸胍溶解和Ni-NTA亲和层析柱纯化及复性即可获得高纯度的活性VWD蛋白,为后续开展红螯螯虾Vg生物学功能研究及开发相应的生物活性物质提供技术支持。 相似文献
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2''-岩藻糖基乳糖( 2''-Fucosyllactose, 2''-FL）是一种岩藻糖化人乳低聚糖,具有预防肠道疾病、提高免疫力、促进大脑发育等重要生理功能。基于基因组水平,通过敲除大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）中2''-FL合成前体物质相关代谢基因,如β-半乳糖苷酶基因（β-galactosidase, lacZ）、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因(undecaprenyl-phosphate glucose-1-phosphate transferase, wcaJ)和GDP-甘露糖基水解酶基因(GDP-mannose mannosyl hydrolase, nudD),构建2''-FL合成底盘细胞;在此基础上,将外源α-1,2-岩藻糖基转移酶基因(α-1,2-Fucosyltransferase, wbgL)和磷酸甘露糖变位酶基因(phosphomannomutase, manB)、甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因(annose-1-phosphate guanylyltransferas, manC)、GDP-D-甘露糖-4, 6-脱水酶基因(GDP-mannose 4, 6-dehydratase, gmd)和GDP-岩藻糖合酶基因(GDP-L-fucose synthase, wcaG)引入到大肠杆菌基因组中,探究在基因组水平过表达2''-FL合成基因对2''-FL产量的影响。结果表明,2''-FL在所构建菌株B-05的摇瓶含量达到了1.99 g·L-1。进一步通过摇瓶发酵优化确定了最优发酵条件：IPTG诱导浓度为0.4 mmol·L-1、诱导时OD600为2.4,诱导温度为28 ℃。在此条件下,摇瓶中2''-FL合成量达到了3.92 g·L-1。最后在5 L发酵罐中,2''-FL含量达到了43.48 g·L-1。研究表明通过将外源2''-FL相关合成基因导入基因组中进行过表达,实现了2''-FL高效合成,为构建整合型2''-FL菌株提供了数据支撑。 相似文献
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为探究氨氮浓度对高温厌氧消化中四环素类抗生素抗性基因（Tetracycline resistance genes，TRGs）绝对丰度变化及其微生态机制，设置氨氮浓度为600、1 100 mg·L-1和1 600 mg·L-1的牛粪高温厌氧消化体系，分析了TRGs、可移动遗传元件和细菌群落结构的变化特征及三者之间的关系。结果表明：氨氮浓度为600 mg·L-1和1 100 mg·L-1时，高温厌氧消化的产气速率和总产气量相似；氨氮浓度为1 600 mg·L-1时，二者均受到抑制。tetC、tetO、tetQ、tetT和tetX的丰度在不同氨氮浓度条件下均减少，但tetA和tetG的丰度在氨氮浓度为1 600 mg·L-1条件下增加了1.05倍和1.85倍。不同处理中细菌群落差异明显，TRGs潜在宿主菌的种类和数目均改变。相关性分析表明TRGs潜在宿主菌的差异可一定程度解释TRGs的丰度变化，但tetA和tetG丰度在氨氮浓度为1 600mg·L-1条件下的增加主要与intI1和intI2的增长有关。综上所述，牛粪中较高的氨氮浓度会增加高温厌氧消化过程中TRGs通过水平基因转移途径增殖的可能性，从而增加TRGs传播的风险。 相似文献
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乌头酸是兰州百合一种重要的根系分泌物,为探究乌头酸对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）百合专化型的作用效果,测定外源乌头酸对F.oxysporum生长及抗氧化酶活性基因表达量的影响。结果表明,浓度为1.175~1 175 mg·L-1时,乌头酸对F.oxysporum的生长具有抑制作用,且随着浓度增加,抑菌作用显著。浓度为1 175 mg·L-1时,与CK相比,乌头酸对F.oxysporum抑菌率、产孢量抑制率和孢子萌发抑制率分别达到91.95%、77%、93%。乌头酸处理引起菌丝体电导率增大,随着浓度和时间的增加,SOD、POD活性呈现先增加后降低的趋势。SOD酶合成基因在转录水平上于11.75~1 175 mg·L-1处理下调表达, 1.175 mg·L-1处理时SOD酶合成基因出现上调,与CK差异不显著。POD酶合成基因在转录水平上所有处理均下调表达。可见,乌头酸可以作为化感抑制剂应用于植物土传病害的防治。 相似文献
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【目的】构建双元植物表达载体,通过遗传转化提高植物的抗逆能力。【方法】将从超旱生、耐盐植物梭梭(Haloxylon ammodendron)中克隆得到的HaBADH基因,定向导入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS中,以HaCMO替换pCAMBIA2300-HaBADH中的抗性基因NPT Ⅱ,构建双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并通过农杆菌介导法将其转入粳稻品种“优引三号”,对所获得的转基因植株进行PCR检验。【结果】成功构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并获得了携带有pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的水稻阳性植株5株,经PCR检测,转入成功。【结论】将梭梭抗逆基因HaBADH和HaCMO构建到一个表达载体中,并成功转化水稻,为转入基因后水稻植株内甜菜碱合成和积累过程的深入分析提供了条件。 相似文献
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为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明：1）在7H染色体的84.30—86.00cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2）该基因长1 033bp,其完整开放阅读框为762bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域（分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸）。3）同源比对与系统进化分析表明：青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具... 相似文献
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【目的】观察乌梅Fructus mume等20种中药的体外抗胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniae活性.【方法】通过乙醇回流、水煎煮和超声波等方法对20种中药进行提取,采用二倍稀释法测定其对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性;并研究抗菌活性较强的几味中药的体外联合抑菌活性.【结果和结论】乌梅、黄连Rhizoma coptidis、诃子Terminalia chebula、秦皮Cortex fraxini、地榆Sanguisorbae officinalis、虎杖Polygonum cuspidatum 6种中药提取物对胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)范围是6.25~50.00 mg/mL;大青叶Isatis indigotica、茵陈Artemisia capillaris、甘草Glycyrrhiza uralensis和白鲜皮Dictamnus dasycarpus 4种中药提取物的MIC范围是50.00~100.00 mg/mL;黄柏Phellodendron amurense、杜仲Eucommia ulmoides、金银花Lonicera japonica、柴胡Bupleurum chinense、蒲公英Taraxacum mongolicum、板蓝根Baphicacanthus cusia、栀子Gardenia jasminoides和黄芪Astragalus membranaceus等10种中药提取物的MIC100.00 mg/mL.联合抑菌试验结果表明,乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合抑菌指数(FICI)≤1,乌梅、虎杖分别与秦皮的FICI2.乌梅、黄连、诃子、虎杖、秦皮、地榆对胸膜肺炎放线杆菌均具有较好的体外抗菌活性;乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合为相加、协同作用;秦皮分别与乌梅、虎杖为拮抗作用. 相似文献
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利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。 相似文献
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孟加拉鲥、美洲鲥和中国鲥形态学比较分析 总被引：1，自引：0，他引：1
观察、解剖107尾孟加拉鲥Tenualosa ilisha、美洲鲥Alosa sapidissima和中国鲥Tenualosa reevesii,详细记叙了孟加拉鲥外部形态和内部结构,运用传统形态学方法比较分析了3种鲥鱼的形态差异.三者形态7项可量性状比值的聚类分析结果显示,孟加拉鲥和中国鲥先聚为一类,再和美洲鲥聚为一类,这与它们的分类地位相一致.外观上,孟加拉鲥臀鳍鳍条短,被1层薄鳞覆盖;美洲鲥的纵列鳞数及体长/体高、体长/头长都大于其他2种鲥鱼.可数性状上,第一外鳃弓鳃耙和脊椎骨数目能明显区分3种鲥鱼.孟加拉鲥、中国鲥和美洲鲥的第一外鳃弓鳃耙数分别为181～219+153～224、95～131+170～175和24～31+47～55;脊椎骨数分别为46～48、37～39和55～57.在内部结构上,根据胃的形状、盲囊部的大小、幽门垂的长短和数量、肠道的弯曲数目及相对长度可以准确鉴定这3种鲥鱼.孟加拉鲥肠道最长,中国鲥次之,美洲鲥肠道最短.3种鲥鱼在消化道结构的差异,预示食性已产生分化. 相似文献
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旨在初步了解丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用。采用分子克隆获得扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因部分片段,应用MEGA软件对其进行进化分析。同时以beta-Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异,最终克隆获得749bp的serpin基因片段。进化分析表明,扩展莫尼茨绦虫serpin基因与多方棘球蚴serpin基因有较近的亲缘关系。标准曲线分析显示,serpin和beta-Tubulin基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时试验结果显示,serpin基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异,从高到低依次为孕节、头节、成节、幼节。由此初步推测,此基因可能在扩展莫尼茨绦虫虫卵发育为六钩蚴的过程中发挥一定作用。 相似文献
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4种蝴蝶雄性生殖系统形态学研究 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】明确4种蝴蝶雄性生殖系统的形态学结构。【方法】将新鲜标本剪下腹部,在Motic SMZ168-BL型显微镜下观察解剖,用Q Imaging Retiga 2000R(CCD)显微成像系统照相,采用Montage图像叠加软件进行图像处理。【结果】描述了4种蝴蝶的雄性生殖系统,其中外生殖器的差异主要表现在囊形突、钩突、背兜、阳基轭片等上,而内生殖器的主要差异表现在精巢、复射精管、单射精管及附腺上。【结论】4种蝴蝶雄性生殖系统的各部分结构特征存在较大差异。 相似文献
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4种绿化树种根系分泌物中的化学成分分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】研究我国南方4种常见绿化树种根系分泌物组分及各组分含量的差异,为城市绿化树种的选择和污染土壤的植物修复与治理提供研究数据。【方法】选取栾树(Koelreuteria paniculata)、紫玉兰(Magnolia liliiflora)、樟树(Cinnamomum camphora)、桂花(Osmanthus fragrans)4种常用绿化树种为试验材料,对其根系分泌物进行GC-MS分析,同时对根系分泌物中的总碳(TC)和总氮(TN)质量浓度进行测定。【结果】植物根系分泌物中检测到的成分数量依次为紫玉兰(35种)、桂花(16种)、栾树(15种)、樟树(7种),4种绿化树种根系分泌物成分主要包括烷烃、苯酚、烯烃、醛、酯、酮、醚、呋喃、胺肟、吡啶、咔唑、喹啉、有机酸、氨基酸等(按类型分),相对含量较高的为酚醛和烷烃类,其中栾树、紫玉兰、樟树、桂花根系分泌物中酚醛类相对含量分别为20.22%,13.61%,41.94%和42.07%,烷烃类相对含量分别为56.65%,7.77%,37.29%和33.13%。有5种化合物(二十烷、二十三烷、2,2′-亚甲基双(6-叔丁基-4-甲基)苯酚、3-羧胺吡啶-N-(2-三氟甲苯基)胺肟、8-羟基-2-甲醛喹啉)在4种绿化树种的根系分泌物中均可检测到;有2种化合物(二十一烷、二十四烷)在栾树、紫玉兰、桂花根系分泌物中均可检测到;顺-14-二十九烯烃在栾树、樟树、桂花根系分泌物中均可检测到。4种绿化树种根系分泌物中TC质量浓度依次为:栾树(28.78mg/L)紫玉兰(24.15mg/L)桂花(8.58 mg/L)樟树(7.98 mg/L);TN质量浓度依次为:栾树(6.65 mg/L)樟树(5.55mg/L)紫玉兰(0.98mg/L)桂花(0.76mg/L)。【结论】不同绿化树种根系分泌物中化合物种类及类型存在差异。 相似文献
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采用生长速率法测定3种生物农药和3种化学药剂对马铃薯晚疫病菌、早疫病菌和黑痣病菌的室内毒力。结果表明：100万孢子/g寡雄腐霉WP对晚疫病菌、早疫病菌和黑痣病菌毒力较好,其EC50分别为 0.041 2 μg/mL、0.000 1 μg/mL和0.052 0 μg/mL;0.3%四霉素AS对3种马铃薯病害病原菌的EC50分别为0.009 3 μg/mL、0.208 4 μg/mL和0.265 9 μg/mL;3%中生菌素WG对3种病原菌的毒力较弱,EC50分别为 7.494 1 μg/mL、2.035 6 μg/mL和20.266 6 μg/mL;20%烯肟·戊唑醇SC对3种病原菌的EC50分别为 0.435 9 μg/mL、0.003 9 μg/mL和1.114 0 μg/mL;50%锰锌·氟吗啉WP对3种病原菌的EC50分别为 1.216 2 μg/mL、0.192 5 μg/mL和5.153 5 μg/mL;30%苯甲·嘧菌酯SC对3种病原菌的EC50分别为 11.270 1 μg/mL、0.227 8 μg/mL和6.071 8 μg/mL。综上所述,100万孢子/g寡雄腐霉WP、0.3%四霉素AS和20%烯肟·戊唑醇SC对马铃薯晚疫病、早疫病和黑痣病室内毒力较好。 相似文献