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基因沉默及其克服策略 总被引：1，自引：0，他引：1
基因沉默现象是导致转基因不能正常表达的主要原因,基因沉默发生在两种水平上,一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平上的基因沉默,另一种是转录后基因沉默,有活跃的启动子,能转录外源基因,核内有正常水平的mRNA,细胞质不积累mRNA。消除甲基化的影响﹑避免使用同源和重复序列和使用核基质结合序列可有效克服基因沉默。 相似文献
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病毒诱导的基因沉默的发展及在植物生物逆境上的应用 总被引：1，自引：1，他引：1
病毒诱导的基因沉默(Virus-indcued gene silencing, VIGS)技术是指带一段包基因序列的重组病毒侵染植物,引起植物同源基因沉默与表型变异,进而通过表型变异进行基因功能分析的方法,是近年发展起来的植物基因功能研究的新技术。为了进一步探讨VIGS应用策略,笔者归纳了VIGS的分子机理、VIGS的载体开发和VIGS技术在植物生物逆境方面的研究应用3 个方面近些年的研究进展,得出了VIGS在植物生物逆境方面的问题及应用价值。 相似文献
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RNA silencing refers collectively to diverse RNA-mediated pathways of nucleotide-sequence-specific inhibition of gene expression. It has been used to analyze gene function and engineer novel traits in various organisms. Here, we review the application of RNA silencing in soybean. To produce soybean lines, in which a particular gene is stably silenced, researchers have frequently used a transgene that transcribes inverted repeats of a target gene segment. Suppression of gene expression in developing soybean embryos has been one of the main focuses of metabolic engineering using transgene-induced silencing. Plants that have enhanced resistance against diseases caused by viruses or cyst nematode have also been produced. Meanwhile, Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation has been used to induce RNA silencing in roots, which enabled analysis of the roles of gene products in nodulation or disease resistance. RNA silencing has also been induced using viral vectors, which is particularly useful for gene function analysis. So far, three viral vectors for virus-induced gene silencing have been developed for soybean. One of the features of the soybean genome is the presence of a large number of duplicated genes. Potential use of RNA silencing technology in combination with forward genetic approaches for analyzing duplicated genes is discussed. 相似文献
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后基因组时代,基因功能研究备受关注,病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术便是一种高效的基因功能鉴定方法。VIGS虽然在模式植物以及经济作物上已经有了大量的研究基础,但在观赏植物领域研究较少。观赏植物具有一定的经济、生态和社会价值,在对其基因功能进行研究时,利用高效的技术方法有利于更好地提高其观赏性、耐胁迫等品质,实现这些价值。所以,为降低观赏植物栽培成本,提高质量,将VIGS技术用于观赏植物研究,可有效解决传统方法效率低,存在技术瓶颈等问题并实现其价值的统一。本综述对VIGS这项简便、快速的技术的分子机理、体系的优化与发展以及其在观赏植物生长发育、遗传改良、抗胁迫等方面基因功能研究上的应用进行总结,希望该技术在不断优化的同时能够在观赏植物基因功能研究中得到更广泛的运用,为观赏植物基因功能鉴定、品质改良和定向育种提供新思路。 相似文献
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RNA沉默(RNA silencing)是真核生物体内普遍保守的、发生在RNA水平的、基于核酸序列同源性相互作用的一种对基因表达的调控机制.通过设计反向重复构建在植物体内产生双链RNA来诱导RNA沉默的方法是一条非常有效的植物抗病毒和功能基因组研究途径.本研究通过两个病毒基因的反向重复构建发展了两种通过小型中间载体设计反向重复构建的方法.其共同特点是构建简易,操作方便,可为通过设计反向重复构建实现植物体内高效持久的RNA沉默提供方法上的参考,促进RNA沉默技术更加广泛深入地应用于植物抗病毒基因工程研究和植物功能基因组研究. 相似文献
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喜树是一种具有药用价值的木本植物,其主要次级代谢产物喜树碱具有良好的抗癌功效。本研究主要通过病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术对喜树碱生物合成途径中的关键酶基因CaCYC1环烯醚萜合酶(Camptotheca acuminata iridoid synthase,CaCYC1)进行瞬时沉默,进而研究该基因对喜树碱生物合成的影响。以喜树叶片总RNA为模板,通过RT-PCR技术克隆CaCYC1基因片段并构建TRV-VIGS重组质粒,转化农杆菌GV3101后侵染喜树叶片,培养20 d后利用qRT-PCR与HPLC技术分析沉默对CaCYC1基因转录水平及喜树碱合成的影响。结果表明:与对照组相比,实验组中CaCYC1基因的相对表达量显著下降49%,叶片中喜树碱的积累量显著下降35%。上述结果表明,本研究所构建的由TRV介导的VIGS体系可有效沉默内源基因的表达,CaCYC1基因可正向调控喜树叶片中喜树碱的生物合成。 相似文献
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Rubisco小亚基基因片段的亚克隆及其瞬时表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
1,5一二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶位于植物叶绿体中,是绿色植物中含量最丰富的蛋白,它催化CO2固定和光呼吸作用的第一步。从含Rubisco小亚基基因片段的pGR107-rbcS质粒中亚克隆出Rubisco小亚基基因片段,将PCR产物与pGEM-T：Easy载体连接,用EcoRI酶切鉴定酶切重组载体,利用低溶点胶回收大约300bp大小的Rubisco小亚基基因片段,将其回收片段与pSLJ75515瞬时表达载体连接,用EcoRI酶切鉴定,筛选出阳性重组体,即为pSLJ75515-rbcS瞬时表达载体。本实验为进一步研究Rubisco小亚基基因功能和基因沉默机制奠定了基础。 相似文献
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多酚氧化酶（PPO）是发生酶促褐变的关键酶,PPO活性过高会使烟叶变褐。为明确烟草NtPPO8基因对PPO活性的影响,建立降低NtPPO8基因表达量的病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）体系,探究使用RNA干扰技术对烟叶NtPPO8基因表达量及PPO活性的影响。以中烟100和K326为材料,分析在移栽后50d进行VIGS载体侵染的植株,并在侵染后10、20、30、40d分别测定NtPPO8基因表达量及PPO活性。结果表明,接种VIGS载体的转化植株,其中在侵染后20d时NtPPO8基因的沉默效率最高,为78.46%;随着侵染时间推移,NtPPO8基因的沉默效率逐渐降低,在接种后40d内有效表达;且转化植株中的病毒载体会随着植株的生长而向上传导,随着接种部位的上移,沉默效率逐渐降低。因此,研究建立VIGS体系能够有效沉默NtPPO8基因的表达,并且有效降低PPO活性,为提高烟叶耐烤性及降低烟叶褐变比例提供了新的思路和方法。 相似文献
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RNA干涉机制的研究进展及植物学意义 总被引：9，自引：0，他引：9
RNA干涉(RNAi)是指由双链RNA(dsRNA)引起的序列特异性基因沉默,其中small RNA(siRNA和microRNA)在RNA干涉机制中起关键作用。本文综述了RNAi中siRNA和microRNA分别介导的作用机制,RNAi在植物中的研究现状,主要包括转基因植物中的RNA干涉和植物病毒诱导的RNA干涉等方面的研究概况。评述了RNAi在植物学研究中的意义,主要包括功能基因的研究、转基因植物的研究及植物抗病性研究。 相似文献
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35S启动子甲基化引起棉花转基因沉默 总被引：5，自引：2，他引：3
用带PBI121质粒的农杆菌LBA4404菌株转化泗棉3号胚性愈伤组织,获得的再生植株进一步对gus和nptⅡ基因进行PCR跟踪检测,共得到97株阳性转基因植株。GUS组织化学检测发现,97株转基因幼苗中有10株GUS检测阴性,嫁接后,只成活一株。利用来源于同一愈伤系的GUS检测阳性植株作为对照,对这一GUS检测阴性的植株进行gus基因沉默机理研究。Southern分析表明,该GUS检测阴性植株与GUS检测阳性植株有相同拷贝数。GUS组织化学检测和RT-PCR分析显示,gus基因在GUS检测阴性植株中没有表达,而nptⅡ基因在这两株转基因棉花中都表达。用限制性内切酶-PCR法分析35S启动子区甲基化发现：GUS检测阴性植株35S启动子区TATA box的HapII/MspI酶切位点发生甲基化,而GUS检测阳性植株该位点没有甲基化。以上研究表明,这株gus沉默的转基因棉花可能是由于其35S启动子区甲基化引起的。 相似文献
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Gan-Yuan Zhong 《Euphytica》2001,118(2):137-144
Transgene technology provides a powerful tool for developing traits that are otherwise difficult to achieve through conventional
breeding. In order to effectively apply the technology to breeding, we need to understand how transgenes behave in plants.
Transgenes may or may not follow Mendelian segregation; their expression can be significantly affected by integration positions
and structures of the transgenic DNA in host genomes; transgenes may become unstable over generations, genetic background
sand environmental conditions; and they may have significantly negative impact on expression of endogenous genes. If not well
understood, the sehurdles could become significant barriers in transgenic breeding. This paper reviews some genetic issues
and pitfalls that are often encountered in transgenic breeding. Because of the necessity of being brief, transgene expression,
silencing, and breeding are the three areas of focuses in this discussion. While molecular mechanisms underlying many of the
transgenic phenomena have not been completely understood, some practical ‘rules’ are now available for creating, evaluating
and selecting desirable transgenic transformants. It can be certain that with more transgenic plants generated and characterized
our knowledge of transgene genetics at both molecular and plant levels will continue to accumulate.
This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date. 相似文献
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遗传转化植物中沉默基因的消除 总被引：5，自引：0，他引：5
随着基因技术在生物科学许多领域的深入开展,转基因沉默问题已引起越来越多的科技工作者的关注。大量转基因植物的研究证明许多因素与基因沉默有关,植物遗传转化中外源基因的整合具有很大的随机性,外源基因的沉默也表现出多种多样的形式,转基因生物的外源基因的沉默可由多种机理造成。外源基因以多拷贝整合到植物细胞基因组中,会发生失活;基因沉默与整合的位点也密切相关,如果整合到转录活跃的常染色体上,毗邻寄主基因的调控系统系列将会影响外源基因的表达;如果插入到重复DNA或异染色质区,外源基因可能会失活;基因沉默并非在每一个发育时期,每一个细胞中总发生,有的外源基因,在幼苗阶段表达是正常的,但萌发到一定阶段后基因表现沉默。转基因沉默通常分为两大类:一类是转录水平上的基因沉默,另一类是转录后的基因沉默。前者是发生在核内的时间,而后者是发生在细胞质中。两者都与甲基化有关,转录水平上的基因沉默主要发生在启动子区域,基因的转录受抑制;而在转录后的基因沉默中,甲基化主要发生在基因的编码区,基因能够转录,产生mRNA,但mRNA在细胞质中被特异性地降解,不能正常翻译成蛋白质造成的,转录后基因沉默发生在细胞质中,转录物能在细胞核中积累但在细胞质中mRNA迅速降解或不能正常地加工。二者在时间上并非简单的前后关系,在空间上也不因为核膜的存在而相互隔离。本文对转基因植物中外源基因沉默的机制,如何降低外源基因的沉默可能性,以提高外源基因的表达率,以及通过DNA糖基化酶等方法适当处理,激活已经沉默的基因等问题进行了评述。 相似文献
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近年来随着对植物抗病机理及信号转导途径的深入研究和探索,以及通过分子生物学手段新的抗病基因和病原菌无毒基因不断被克隆,科研人员对于植物三型信号分泌系统中抗病（R）基因和无毒(Avr)基因的结构、功能,作用模式及作用机制具有更加深入的认识。深入研究病原菌—寄主之间的相互作用关系,为制定更为有效的植物病害防治措施提供了依据。该文通过对三型信号分泌系统中植物病原识别受体的组成部分,抗病基因的结构域及种类,抗病基因与无毒基因及相互作用的两种模式及具体机制的总结,从植物抗病基因角度探讨了三型信号分泌系统下植物的抗病机制并在此基础上进行了前景展望。 相似文献
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构建真菌基因敲除突变体的传统方法周期较长,为了快速检测和高通量筛选具有特定功能的目标基因,本研究利用小分子RNA干涉技术,沉默了黄曲霉毒素生物合成关键基因,有效降低了黄曲霉毒素B1(AFB1)的生物合成。通过设计合成人工小干涉RNA(artificial siRNA),特异靶向黄曲霉毒素合成路径的关键基因aflR,将siRNA直接转化黄曲霉原生质体,有效沉默了黄曲霉毒素合成的关键调控基因aflR,并导致AFB1的合成明显减少。利用特异靶向黄曲霉毒素合成路径中其他11个靶标基因的siRNAs,通过原生质体转化方法可直接沉默这些基因,沉默后这些基因的转录水平均显著降低,其中hypC和aflW两个基因沉默后AFB1的生物合成量与对照相比下降显著。此外,利用特异靶向黄曲霉毒素合成基因簇外基因的siRNA,如pks-nrps基因,通过siRNA干涉技术沉默该基因同样可显著降低AFB1的合成。因此,本研究借助小分子RNA干涉技术,建立了一种快速检测和高通量筛选黄曲霉毒素生物合成路径相关基因的反向遗传学方法。 相似文献
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非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer proteins,nsLTPs)是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白,具有多种生物学功能。为研究nsLTPs在调控植物应答生物与非生物胁迫的反应中起的作用,本研究以本生烟(Nicotiana benthamiana)为材料,成功克隆非特异脂质转移蛋白NbLTP1全长基因,其开放阅读框序列为360 bp,编码119个氨基酸,分子重量为12.44 kD,为疏水性蛋白,等电点为7.45。对NbLTP1蛋白质三级结构进行了预测和分析,并进一步构建了烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的病毒诱导的基因沉默载体TRV:NbLTP1。荧光定量PCR结果表明通过VIGS可以显著抑制NbLTP1基因的表达。此外还通过In-Fusion克隆技术快速成功构建了pCAMBIA1305-NbLTP1-3*HA过量表达载体。本研究为下一步遗传转化、后续研究NbLTP1调控植物防御生物与非生物胁迫的分子机理、培育新种质提供理论依据。 相似文献
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病毒诱导的基因沉默（VIGS）具有独特优势,被广泛应用于基因功能验证。高效基因沉默体系的建立和优化是对目标基因功能进行研究的前提和基础。以番茄品种money maker和携带八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因序列的TRV病毒载体为材料,研究了农杆菌不同OD值、不同侵染方法以及侵染后不同培养温度对PDS基因沉默株率的影响。结果表明,农杆菌OD值分别为0.50、1.00和1.50时,PDS基因的沉默株率分别为5%、13%和6%;当农杆菌OD值为1.0时,采用注射法、真空浸润法和注射处理24h后再进行真空浸润后的PDS基因沉默株率分别为13%、30%和15%;侵染后的培养温度对于基因沉默株率也有显著影响,在25℃时的沉默株率为13%,22℃时沉默株率达到46%。以上研究表明,农杆菌OD值为1.00时,注射24h后再进行真空浸润,接种后植株在22℃下生长能够提高番茄目标基因的沉默株率。 相似文献