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重组人早孕因子的表达与纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
早孕因子(EPF)是具有免疫抑制和生长调节活性的妊娠相关蛋白,为目前最早确认妊娠的生化指标之一。为获得人早孕因子重组蛋白,利用PCR技术扩增人早孕因子基因,克隆入原核表达载体pGEX-6p-1,与GST基因相融合,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌表达菌株BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,以SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白的表达,利用GST树脂纯化表达蛋白。结果成功构建重组表达质粒pGEX6P-EPF,在大肠杆菌中诱导表达了GST- EPF融合蛋白,表达蛋白分子量为37.3kDa,并能被抗GST单克隆抗体特异识别,GST亲和层析纯化,制备了EPF重组蛋白。 相似文献
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从长白猪肝脏细胞中提取总RNA，通过RT-PCR法扩增pMBL-A基因，与pMD18-T载体连接进行TA克隆，得到猪甘露聚糖结合凝集素A（porcine mannan-binding lectin A，pMBL-A）基因。再亚克隆到pPROEXHTb表达载体上，构建重组表达质粒。将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌中诱导表达重组pMBL-A蛋白，通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。结果成功扩增得到包括完整开放读码框长为875bp的全长cDNA片段，并原核表达了重组蛋白，为进一步研究该蛋白的遗传特征以及为猪遗传育种方面的研究提供依据。 相似文献
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长白猪甘露聚糖结合凝集素A基因的 克隆与原核表达 总被引：2，自引：2，他引：0
从长白猪肝脏细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增pMBL-A基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆,得到猪甘露聚糖结合凝集素A（porcine mannan-binding lectin A,pMBL-A）基因。再亚克隆到pPROEXHTb表达载体上,构建重组表达质粒。将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌中诱导表达重组pMBL-A蛋白,通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。结果成功扩增得到包括完整开放读码框长为875bp的全长cDNA片段,并原核表达了重组蛋白,为进一步研究该蛋白的遗传特征以及为猪遗传育种方面的研究提供依据。 相似文献
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根据猪α1干扰素(pocine interferon-alpha1,poIFN-α1)的全基因序列(EU364896)设计合成1对特异引物,通过RT-PCR从三元杂交仔猪外周血淋巴细胞扩增出poIFN-α1全基因,将该基因克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T-poIFN-α1,进行测序。以pGEM-T-poIFN-α1为模板,经PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α1基因,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达载体pGEX-6P-poIFNα1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定,并确定蛋白最佳表达条件。序列分析表明,克隆的poIFN-α1基因全长546bp,编码181个氨基酸,前23个氨基酸组成信号肽,无糖基化位点。SDS-PAGE和Western blotting证实重组表达菌经IPTG诱导后,可表达相对分子质量约46ku的融合蛋白(GST-poIFN-α1)。当以1.0mmol/L的IPTG于37℃下诱导表达9h时,蛋白表达量最高。poIFN-α1基因的克隆与表达为进一步研究其抗病毒活性,开发病毒治疗和疫苗免疫增强用生物制剂奠定了基础。 相似文献
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犬传染性肝炎病毒IX基因的克隆及原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
摘 要：本试验通过对犬传染性肝炎病毒（CAV-I）基因组的提取,通过PCR扩增获得了大小为1109bp CAV-I病毒结构IX基因片段, 成功地将IX基因克隆至载体pMD-18T中,构建了pIX原核表达载体pGEX-4T1-IX,将重组质粒pGEX-4T1-IX转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,并实现了IX基因在该菌中的高效表达。对表达产物进行了Western blot 检测,分析结果表明表达蛋白能与抗CAV-I阳性血清发生特异性的抗原-抗体反应,为CAV-I的血清学诊断和免疫监测提供大量优质的抗原奠定了基础。 相似文献
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鸡α干扰素基因的克隆、原核表达及抗病毒活性测定 总被引：6，自引：0，他引：6
通过PCR技术从罗曼鸡肝脏基因组中扩增鸡α干扰素(ChIFN-α)全基因,并克隆和测序.序列分析表明,ChIFN-α基因全长为582 bp,亚克隆其成熟蛋白编码基因489 bp,利用基因重组技术构建了重组质粒,使ChIFN-α置于原核表达载体pQE30的T5启动子下并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag 融合.经酶切和PCR鉴定,DNA测序证实重组质粒pQEChIFN-α构建正确;将pQEChIFN-α转化大肠杆菌M15感受态细胞,用IPTG诱导表达.SDS-PAGE和Western blot证实表达出分子质量为19.80 kDa的融合蛋白.表达的蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性处理后,在Vero细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为1.16×103 U/mg.本研究成功表达了ChIFN-α,表达的重组蛋白具有一定的生物活性. 相似文献
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为克隆、表达单核细胞增生李斯特菌sRNA分子伴侣蛋白hfq基因,并纯化重组蛋白,通过PCR的方法从单核细胞增生李斯特菌基因组DNA中扩增出hfq基因,将扩增产物克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,再将hfq基因亚克隆至表达载体pET-32a（＋）中,成功构建pET-32a（＋）-hfq原核表达载体。然后,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,通过IPTG进行诱导表达,对表达蛋白进行可溶性分析,并采用Ni-NTA纯化目的蛋白。结果显示：克隆的hfq基因全长234 bp,编码77个氨基酸,通过SDS-PAGE可以检测到27 kDa的蛋白特异性条带;并从上清中纯化得到了Hfq融合蛋白。为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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本研究对编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）非青霉素结合蛋白2a（PBP2a）的转肽酶区（TPase）原核表达并进行Western blot鉴定。首先通过PCR方法由MRSA基因组中扩增转肽酶区基因片段,并构建pGEX-6p-1-TPase重组质粒,转化BL-21,诱导目的蛋白表达,然后进行Western blot鉴定。结果表明,成功构建出pGEX-6p-1-TPase原核表达载体,并成功表达出PBP2a的转肽酶区蛋白（TPase）,为其进一步的研究和应用奠定了基础。 相似文献
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为了进行锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus Virus,KHV)诊断方法、疫苗研制和蛋白功能研究。通过选择基因保守性极强的ORF1基因作为研究对象,设计1对特异性引物进行PCR克隆。目的基因与表达载体PET构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)后诱导表达。再将成功表达的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。PCR产物经电泳显示,所扩增的基因长度774 bp,与目的基因长度相符。蛋白表达产物经SDS-PAGE和Western-bolt检测,重组表达质粒K1-PET成功诱导表达,表达蛋白为37.3 KD为包涵体。免疫小鼠获得多克隆抗体,经酶联免疫检测发现其效价达到1:27000,表明表达出的目的蛋白具有免疫原性,实验获得的表达蛋白和多抗血清为KHV的疫苗研制和免疫学检测方法的建立奠定了基础。 相似文献
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摘要：克隆大肠杆菌乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl CoA Carboxylase, ACCase）的生物素羧基载体蛋白（biotin carboxyl carrier protein,BCCP）亚基基因accB,构建accB的原核表达载体pGEX-4T-accB,转化大肠杆菌BL21（DE3）工程菌株, IPTG诱导进行融合表达,成功诱导表达了GST-accB融合蛋白,大小为43KDa。 相似文献
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细胞分裂素氧化酶降解细胞分裂素,从而调控植物的生长发育,克隆和分析玉米细胞分裂素氧化酶基因(ZmCKX),为研究ZmCKX在玉米抗逆反应中的作用奠定基础。运用RT-PCR和RACE技术克隆了ZmCKX基因的cDNA全长,并对其进行了初步的生物信息学分析。琼脂糖凝胶电泳鉴定结果表明,PCR扩增出一条约1035bp的片段,与目的片段大小相似。将目的片段与pMD-19t构建的pMDZmCKX重组质粒并转化为DH5α,经检测片段与原始片段大小相同。Blastn分析结果表明,其与ZmCKX1的相似性为99%。对该基因序列分析表明,ZmCKX基因编码的蛋白的开放阅读框为1035bp,起始位点为23bp,终止位点为1057bp。ZmCKX基因长1035bp,编码344个氨基酸。它与ZmCKX1基因核苷酸同源性99%。ZmCKX基因编码的蛋白是存在于细胞质中的亲水蛋白。 相似文献
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为构建灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶(Bc KMO)基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的Bc KMO蛋白。以灰葡萄孢野生型BC22为试材,通过反转录PCR扩增Bc KMO基因,回收Bc KMO基因片段克隆到p MD19-T载体中,测序正确后,酶切p MD19-T-Bc KMO和带有GST标签蛋白的p GEX4T-1质粒,将目的片段进行连接,构建Bc KMO基因的原核表达载体p GEX4T-1-Bc KMO-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的原核载体转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与GST标签蛋白融合的Bc KMO蛋白,大小约71 k Da。SDS-PAGE分析表明,该蛋白在0.2 mmol/L IPTG诱导12 h时高效表达;Western Blot结果发现目的蛋白能与GST特异性抗体起特异性反应,表明Bc KMO基因的体外诱导表达成功。 相似文献
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栀子苷对小鼠急性肺损伤保护机制的研究 总被引：1，自引：1，他引：0
为了探究栀子苷能否对脂多糖(LPS)致小鼠急性肺损伤发挥保护作用及其潜在的作用机制。雄性Balb/c小鼠,于鼻腔滴注LPS前1 h腹腔注射栀子苷(50 mg/kg)或者地塞米松注射液(5 mg/kg),滴注LPS 24 h后,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-6和IL-10的浓度。通过细胞分类计数法分析BALF中细胞总数、巨噬细胞和中性粒细胞的变化。采用蛋白印迹法(Western-blot)分析核转录因子-κB（NF-κB）信号转导通路激活的程度。腹腔注射栀子苷可降低小鼠肺干湿比（W/D值）;改善肺组织病理学结构,减少肺泡出血和炎性细胞浸润且伴有髓过氧化物酶活性下降;抑制促炎性细胞因子TNF-α和IL-6分泌,促进抗炎性细胞因子IL-10生成。栀子苷通过缓减炎症反应保护LPS致小鼠急性肺损伤,其机制可能与阻止NF-κB信号转导通路的激活有关。 相似文献
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旨在克隆藏猪胰岛素样生长因子1(IGF-1)的成熟肽基因,并进行原核表达的研究。提取藏猪肝脏组织RNA,通过RT-PCR扩增出藏猪IGF-1全长基因,构建重组质粒p MD19-T-IGF-1,以p MD19-T-IGF-1质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽序列并构建成熟肽p ET-32α-IGF-1表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),对IPTG诱导剂浓度和诱导时间进行优化,Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白后采用Western Blot对其鉴定。结果显示,IGF-1成熟肽基因(315 bp),成功构建了成熟肽p ET-32α-IGF-1原核表达质粒;重组大肠杆菌BL21-IGF-1以包涵体形式表达出分子量约31 k Da融合蛋白,最优IPTG浓度为0.5 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为10 h;纯化获得了高纯度的融合蛋白,经鉴定IPTG诱导表达和纯化的蛋白为IGF-1融合蛋白。结果表明,成功构建了表达质粒p ET32α-IGF-1及获得重组大肠杆菌BL21-IGF-1,表达了藏猪IGF-1成熟肽融合蛋白及该蛋白具有抗原抗体反应活性。 相似文献
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通过对白屈菜低温应答过程的转录组分析发现膜脂不饱和化相关基因的表达在一定过程中发生变化,脂肪酸去饱和酶基因FAD2在随温度的变化趋势为正"V"型,且表达量变化显著。利用NCBI等在线软件对序列进行相关生物学信息分析,并对白屈菜FAD家族成员FAD2基因的完整开放阅读框(ORF)进行克隆,并命名为CmFAD2。选用克隆载体pMD-19-T,转化大肠杆菌DH5α,测序验证序列正确性及完整性。将目的基因与植物表达载体pRI-201-AN连接构建重组DNA pRI-201-AN-Cm FAD2,电击法转化农杆菌LBA4404,利用菌液PCR法验证成功。该基因可作为药用植物抗寒品种创制的候选基因。 相似文献