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旨在研究鸽毛滴虫是否分泌外泌体及虫源外泌体的蛋白组成和功能,为探索外泌体在鸽毛滴虫寄生过程中的作用奠定基础。采集鸽毛滴虫感染个体口腔及咽部病灶处样本,进行分离培养及纯化,使用显微镜鉴定虫体形态,提取DNA并比对其序列,确定培养物是否为鸽毛滴虫虫株;通过对培养液上清进行超速离心,透射电子显微镜、Western blot技术和纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）鉴定培养液上清中是否含有虫源外泌体;最后通过Label-free技术分析虫源外泌体的蛋白质谱表达。结果显示,虫体具有明显的毛滴虫形态及特征,与鸽毛滴虫ITS1/5.8S/ITS2基因比对率达98%。从虫体培养液中提取的囊泡经透射电子显微镜观察具有明显的茶托样结构;NTA结果显示,粒径集中于125.1 nm,峰值粒径为132.3 nm,占比99.3%;CD63和TSG101等外泌体标记蛋白的条带明显,表明提取物为外泌体。质谱结果显示,烯醇酶、3-磷酸甘油醛-脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶和延伸因子为表达量较高的蛋白质。GO功能注释显示外泌体蛋白富集到细胞内和胞浆等细胞组分,发挥GTP连接和GTP酶活性功能,参与小GTPase介导的信号转导与糖酵解等过程。KEGG通路富集表明,虫源外泌体蛋白主要富集于代谢途径、糖酵解/糖异生、抗生素的生物合成和次级代谢产物的生物合成等通路。本研究发现鸽毛滴虫可以分泌外泌体,并对虫源外泌体进行蛋白质谱分析,提示虫源外泌体中的蛋白质在寄生虫的能量代谢、信号转导及生物合成等过程中发挥重要作用。 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(9)
提取小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)疫苗毒N75-1株感染以及未感染对照山羊外周血单个核细胞(PBMCs)源外泌体,通过纳米颗粒示踪分析技术(NTA)测定提取外泌体粒径和分布范围,并通过Western blot技术和流式细胞术检测外泌体表面标志物CD63和CD81的表达水平;然后将PPRV感染PBMCs源外泌体与正常山羊PBMCs共培养,同时设定正常山羊PBMCs源外泌体共培养组以及PBMCs培养对照组,通过荧光定量PCR法和Western blot技术检测以上各组受体细胞中PPRV特异性受体淋巴信号活化分子(SLAM)表达水平变化。结果显示,PPRV感染及对照山羊PBMCs中外泌体粒径主要分布在100 nm,且感染组外泌体(Exo-PPRV)分泌水平较正常对照组(Exo-Mock)显著升高(P0.05);Exo-PPRV共培养组SLAM mRNA和蛋白质表达水平较Exo-Mock组显著上调(P0.05),Exo-Mock组与PBMCs培养对照组间SLAM mRNA和蛋白质表达水平差异不显著。结果表明,PPRV感染能够诱导山羊PBMCs中外泌体分泌水平升高且该外泌体对未感染PBMCs中PPRV受体SLAM的表达水平具有显著的正调控作用。 相似文献
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为了比较不同方法提取山羊乳腺上皮细胞重编程过程中细胞上清液外泌体的效果，试验采用超速离心法和试剂盒法提取细胞上清液中的外泌体，利用透射电子显微镜观察外泌体形态，以纳米流式仪检测外泌体浓度和粒径，Western-blot法检测外泌体表面标志物蛋白并通过Image J软件分析其相对表达量。结果表明：超速离心法和试剂盒法提取的外泌体均具有圆盘状的双层膜结构，且轮廓清晰，但是试剂盒法提取的外泌体中存在其他蛋白质颗粒。超速离心法提取获得的外泌体较为分散，外泌体粒径集中在55～60 nm之间；试剂盒法提取获得的外泌体大小更为均一，外泌体粒径集中在58 nm左右。两种方法提取的外泌体表面特异性标志物CD63和TSG101蛋白均呈阳性。试剂盒法提取的外泌体浓度极显著高于超速离心法(P<0.01),提取的外泌体表面特异性标志物CD63和TSG101蛋白相对表达量也极显著高于超速离心法(P<0.01)。说明超速离心法和试剂盒法均可以从山羊乳腺上皮细胞重编程过程的细胞上清液中提取出外泌体，区别在于超速离心法提取的外泌体纯度更高，试剂盒法提取的外泌体浓度更高。 相似文献
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【目的】建立巨噬细胞免疫抑制模型,探究菊苣酸(cichoric acid, CA)对磷酰胺氮芥(phosphoramide mustard, PM)诱导巨噬细胞免疫抑制的作用及调控机制,为将CA开发为临床防治免疫抑制性疾病的新型药物提供理论依据。【方法】以巨噬细胞源性外泌体为研究对象,采用ExoQuick免疫沉淀试剂盒提取外泌体,用透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)、纳米颗粒跟踪分析技术(nanoparticle tracking analysis, NTA)、Western blotting鉴定外泌体形态、粒径大小与浓度,以及表面标志蛋白CD63、HSP90的表达。同时,采用浓度为3μmol/L的PM诱导巨噬细胞24 h,建立免疫抑制模型后,给予低、中、高剂量CA(25、50、100μmol/L)进行干预,通过CCK-8测定细胞活力、中性红检测细胞吞噬能力及NTA测定外泌体粒径大小与浓度,研究CA介导外泌体增强免疫的作用机制。【结果】提取的巨噬细胞源性外泌体杯状形态完整,粒径在30～200 nm之间,标志蛋白表达清晰,具有良好的生物... 相似文献
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为探究育雏阶段番鸭肝脏中外泌体携带miRNA的种类及其涉及的功能，试验采集3周龄雏番鸭肝脏制备原代肝细胞，培养3 d，离心取上清，试剂盒法分离肝细胞外泌体，电子显微镜观察外泌体形态和粒径，免疫印迹法检测外泌体CD81蛋白表达丰度。提取外泌体总RNA,miRNA测序后进行注释、GO和KEGG功能富集分析。结果显示：雏番鸭肝细胞外泌体为直径30～100 nm的囊泡小体，呈“杯托”状；标志性蛋白CD81免疫印迹结果呈阳性表达；miRNA测序共获得了59个新注释miRNA,GO功能富集结果主要涉及单有机体过程、刺激应答、多细胞有机体过程、定位、细胞器、胞外区绑定分子功能等；KGEE功能富集结果显示主要涉及淀粉和蔗糖代谢、MAPK信号通路、氨基糖和核苷酸糖代谢、肌醇磷酸代谢和磷脂酰肌醇信号传导系统等通路。研究表明番鸭肝脏外泌中的miRNA种类丰富，涉及多种生理功能。 相似文献
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研究旨在从水牛犊牛血浆中分离外泌体,并对分离的外泌体进行分子生物学特征分析和鉴定。采用差速离心法分离3头水牛犊牛的血浆外泌体,并在透射电子显微镜下观察其形态,使用纳米粒度及Zeta电位仪对提取的外泌体进行粒径大小分析,应用Western blotting方法检测外泌体标记蛋白钙联蛋白（Calnexin）、肿瘤易感基因101（TSG101）、CD9、CD81在3头水牛犊牛血浆外泌体中的表达情况。结果显示,从水牛犊牛血浆中分离的外泌体形态多为圆形和椭圆形,直径在30~150 nm;Western blotting检测结果表明,在水牛血浆外泌体表面,特异性蛋白Calnexin、TSG101和CD81阳性表达,CD9不表达。本研究从形态学和分子生物学特征等方面证实研究获得的提取物为外泌体,由此说明,差速离心法可以成功分离提取水牛犊牛血浆中的外泌体,为水牛外泌体的后续研究提供了重要技术基础和参考。 相似文献
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为探讨猪脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)来源外泌体对脂肪源神经干细胞(neural stem cells, NSCs)诱导的调控作用，采用含20 ng/mL表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和2%B27的无血清DMEM/F12培养基，将ADSCs诱导成细胞球，通过免疫荧光技术检测神经干细胞标记蛋白巢蛋白(Nestin)和神经干细胞RNA结合蛋白(Musashi1)的表达，提取ADSCs外泌体，通过纳米粒径跟踪分析(NTA)和透射电镜技术对外泌体进行检测，PKH67染色后荧光显微镜观察ADSCs对外泌体的摄取情况，外泌体与ADSCs共培养作为试验组，不加外泌体作为对照组，qPCR检测外泌体对Nestin和Musashi1基因表达的影响。结果显示：ADSCs经诱导培养获得细胞球，免疫荧光检测显示所获得的细胞球Nestin和Musashi1抗体阳性，表明为诱导形成了神经干细胞；提取的AD... 相似文献
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旨在分离感染PCV2的PK-15细胞分泌的外泌体,探讨其在PCV2感染淋巴细胞中的作用。提取PCV2感染PK-15细胞上清液中的外泌体,利用透射电镜观察外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析测定外泌体粒径、Western blot检测外泌体标记蛋白分子（CD81、TSG101）;PKH67标记外泌体后检测细胞对外泌体的摄取;提取PCV2-外泌体基因组,检测PCV2 Rep和Cap基因;利用间接免疫荧光试验检测PCV2-外泌体感染PK-15细胞后PCV2病毒定位;通过绝对定量PCR检测PCV2-外泌体对淋巴细胞的感染率;利用CCK-8法检测淋巴细胞增殖;利用Annexin V-FITC/PI检测淋巴细胞凋亡率。透射电镜和外泌体粒径分析结果显示,PK-15细胞分泌的外泌体为双层膜的囊泡,直径30~200 nm;Western blot结果显示PK-15细胞分泌的外泌体存在特异性标记蛋白CD81和TSG101;外泌体摄取试验结果显示PCV2-外泌体能够被细胞摄取;PCR结果表明PCV2-外泌体基因组中含有PCV2 Rep和Cap基因;间接免疫荧光结果显示,与PCV2直接感染相比,PCV2-外泌体感染的淋巴细胞中,PCV2病毒拷贝显著升高,差异明显（P<0.01）,外泌体裂解后感染淋巴细胞能力与PCV2病毒无显著差异;PCV2-外泌体可显著抑制淋巴细胞增殖（P<0.01或P<0.05）;PCV2-外泌体显著提高淋巴细胞凋亡率。PCV2感染PK-15细胞的外泌体中携带病毒基因,感染淋巴细胞后使细胞增殖降低和细胞凋亡增加。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2020,(7)
旨在分离感染PCV2的PK-15细胞分泌的外泌体,探讨其在PCV2感染淋巴细胞中的作用。提取PCV2感染PK-15细胞上清液中的外泌体,利用透射电镜观察外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析测定外泌体粒径、Western blot检测外泌体标记蛋白分子(CD81、TSG101);PKH67标记外泌体后检测细胞对外泌体的摄取;提取PCV2-外泌体基因组,检测PCV2 Rep和Cap基因;利用间接免疫荧光试验检测PCV2-外泌体感染PK-15细胞后PCV2病毒定位;通过绝对定量PCR检测PCV2-外泌体对淋巴细胞的感染率;利用CCK-8法检测淋巴细胞增殖;利用Annexin V-FITC/PI检测淋巴细胞凋亡率。透射电镜和外泌体粒径分析结果显示,PK-15细胞分泌的外泌体为双层膜的囊泡,直径30～200 nm;Western blot结果显示PK-15细胞分泌的外泌体存在特异性标记蛋白CD81和TSG101;外泌体摄取试验结果显示PCV2-外泌体能够被细胞摄取;PCR结果表明PCV2-外泌体基因组中含有PCV2 Rep和Cap基因;间接免疫荧光结果显示,与PCV2直接感染相比,PCV2-外泌体感染的淋巴细胞中,PCV2病毒拷贝显著升高,差异明显(P0.01),外泌体裂解后感染淋巴细胞能力与PCV2病毒无显著差异;PCV2-外泌体可显著抑制淋巴细胞增殖(P0.01或P0.05);PCV2-外泌体显著提高淋巴细胞凋亡率。PCV2感染PK-15细胞的外泌体中携带病毒基因,感染淋巴细胞后使细胞增殖降低和细胞凋亡增加。 相似文献
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外泌体是细胞主动分泌的纳米级囊泡,参与机体多种生理和病理学过程,具有重要的生物学功能。为了探究外泌体源性相关蛋白在绵羊痘病毒感染过程中的作用机制,本试验利用绵羊痘病毒感染绵羊睾丸细胞,分离外泌体,并对分离的外泌体源性蛋白进行质谱和蛋白组分析。将获得的原始数据与蛋白质数据库进行匹配和质检筛选,共鉴别出453种宿主细胞相关蛋白和6种绵羊痘病毒蛋白。GO通路分析表明,感染绵羊痘病毒的绵羊睾丸细胞外泌体源性蛋白参与复杂的细胞生理过程,主要包括免疫反应、内吞途径、代谢及生物调控等过程,在绵羊痘病毒的感染和扩散过程中起着重要作用。这有望为绵羊痘疫病的诊断试剂、新型疫苗及治疗药物的研发提供理论基础和依据。 相似文献
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为了明确刺五加多糖(Acanthopanax senticosus polysaccharide,ASPS)处理对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的猪肠上皮细胞(IPEC-J2)来源的外泌体中miRNAs表达及功能的影响,试验分组培养IPEC-J2细胞,提取外泌体进行鉴定并对外泌体携带的miRNAs进行生物信息学分析。结果表明,各组提取的外泌体均呈包膜完整的圆形或椭圆形囊泡状,均能表达外泌体标志蛋白CD9。高通量测序结果显示,与LPS处理组相比,ASPS处理组共有277个差异表达的miRNAs(P<0.05),其中223个miRNAs基因表达上调,54个miRNAs基因表达下调。基因本体论(gene ontology,GO)与京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KGEE)通路富集分析发现,这些差异表达的miRNA通过转录调控靶基因可富集于细胞自噬和细胞凋亡及其相关信号通路。ASPS处理IPEC-J2细胞后再进行LPS刺激能显著影响IPEC-J2细胞外泌体中miRNAs的表达。差异表达的... 相似文献
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为探索水牛高低活力精子的差异表达蛋白质（Differentially Expressed Proteins,DEPs）变化，并揭示水牛精子活力相关蛋白质的分子调控机制，本研究通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，对成年摩拉水牛精浆、精子、精浆外泌体蛋白质种类及表达量进行比较分析。按照精子活力分为高活力组（0.67±0.02）和低活力组（0.34±0.04），分别提取其精浆外泌体蛋白质进行差异表达分析，鉴定到DEPs共160个。通过GO分析和KEGG通路分析发现，DEPs显著富集到精子部位的顶体素结合蛋白（ACRBP）、精子发育相关的生物调节过程以及“FcγR介导的吞噬作用”、“PPAR信号通路”等多个信号通路。通过构建精浆外泌体DEPs互作网络进一步分析发现，ACRBP、IZUMO1、SPACA1、ADAM2等蛋白质在精子发育调控通路发挥重要作用。 相似文献
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本试验旨在通过形态学观察及基于18S rRNA和5.8S rRNA基因序列分析鉴别导致猕猴腹泻的肠道内毛滴虫,收集腹泻猕猴的新鲜粪便样本,经直接涂片、碘液染色后镜检观察寄生虫虫体形态;提取粪便总DNA,针对三毛滴虫18S rRNA和五毛滴虫5.8S rRNA基因序列设计特异性引物进行PCR扩增,对测序结果进行序列比对与进化树构建。形态观察结果显示,毛滴虫呈梨形或近似卵圆形,滋养体前鞭毛2～5条,后鞭毛1条;三毛滴虫18S rRNA和五毛滴虫5.8S rRNA序列PCR扩增仅获得18S rRNA基因序列,18S rRNA测序结果与GenBank中公布的来自犬的胎儿三毛滴虫序列的相似度高达97.2%。利用形态观察和分子生物学分析确认来自猴源的毛滴虫为猕猴源三毛滴虫。本试验结果对猕猴肠道寄生虫的鉴定与分析具有重要的临床诊断意义。 相似文献
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为分析囊型包虫原头蚴(PSC)分泌的外泌体(Exosome)对树突状细胞(DCs)活化和分泌细胞因子的影响,本研究采用高速离心法结合外泌体提取试剂盒分离原头蚴分泌的外泌体(PE),收集的PE沉淀中加入去离子水低渗裂解离心,提取超滤后的蛋白浓缩液即为原头蚴外泌体超滤裂解物(PEL)。利用免疫磁珠从健康ICR小鼠脾脏中分选DCs,分别加入PE、LPS、PEL、PBS进行刺激培养,24 h后收集培养细胞及培养上清,利用流式细胞术检测DCs表面活化分子的表达水平及细胞因子分泌情况。结果显示:4组DCs表面表达CD40、CD80、CD86、MHCⅡ的比例相比,PEL组结果明显高于PE组,这两组较PBS组均显著升高(p<0.05),但3组均低于LPS组。PE、PEL组DCs培养上清中IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α均显著高于PBS组,且PEL组IL-12、TNF-α高于PE组,IL-6、IL-10水平低于PE组。以上结果初步证实PE能刺激DCs活化和释放细胞因子,低渗裂解超滤提纯外泌体蛋白并去除miRNA成分的PEL能够更有效激活DCs活化和促进细胞因子释放,表明外泌体蛋白可诱导抗感染免疫应答,exosomal miRNA成分可能参与虫体免疫逃逸。本研究为后续进一步探索包虫感染及抗感染免疫应答机理提供实验依据。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2017,(3)
为了筛选与柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(Eimeria tenella apical membrance antigen 1,EtAMA1)存在互作的子孢子蛋白,以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,PCR扩增EtAMA1基因胞外区,将扩增产物与p GEX-6P-1连接,构建原核表达质粒p GEX-6P-1-EtAMA1,表达、纯化重组蛋白EtAMA1-GST。纯化的重组蛋白经Western blot验证,结果显示在75 k Da处有单一的目的条带,证实了所获得的蛋白为EtAMA1-GST融合蛋白。将EtAMA1-GST蛋白、GST蛋白和PBS分别与谷胱甘肽琼脂糖珠孵育后,再分别与子孢子裂解物共孵育,洗脱液经SDS-PAGE分析后,结果显示三者之间的条带明显不同。将差异条带切下进行质谱分析,对获得的蛋白质肽段与Uniprot中鸡球虫蛋白质数据库进行Blast比对,初步获得了10个与EtAMA1存在潜在互作的柔嫩艾美耳球虫子孢子蛋白,包括微线体蛋白、糖酵解酶类、肌动蛋白相关因子以及一些保守蛋白等,他们广泛参与了虫体的入侵、发育、能量代谢等生物学过程。研究结果为进一步阐明EtAMA1在球虫入侵宿主细胞中发挥重要作用的分子机制奠定了基础。 相似文献
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核糖体蛋白在蛋白质的生物合成、细胞的代谢与凋亡、机体免疫、信号转导等方面有重要作用。采用RT-PCR方法克隆了柞蚕(Antheraea pernyi)核糖体蛋白基因S3a的开放阅读框(ORF),ORF序列长795bp,编码264个氨基酸。序列比对表明,柞蚕S3a蛋白与其它10个物种S3a蛋白的相似性介于72%～99%之间,其中与柳蚕(Actias selene)S3a蛋白的相似性最高。用RT-PCR方法分析该基因在柞蚕幼虫组织中的表达情况,结果显示柞蚕S3a基因在柞蚕幼虫的血液、中肠、丝腺和脂肪体组织中均有表达,且转录水平无显著差异。SDS-PAGE和Westernblotting检测显示柞蚕S3a基因在大肠杆菌中获得了正确表达。 相似文献
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为了筛选出环形泰勒虫TRAP蛋白在虫体入侵媒介蜱唾液腺过程中相互作用蜱源蛋白,构建了能够用于酵母双杂交筛选系统的重组诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A。本研究以环形泰勒虫裂殖体为材料,根据环形泰勒虫TRAP-A结构域的基因序列设计引物,经过PCR扩增获得576 bp的基因片段,将其连接到线性化载体pGBKT7上。经双酶切鉴定和序列分析以及重组诱饵质粒在酵母双杂交系统中的自激活、细胞毒性及其表达情况检测,结果显示,本研究成功构建了酵母双杂交重组诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A,构建的诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无自激活活性和细胞毒性,且构建的诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A可以在Y2HGold酵母菌内正确表达。表明所构建的诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A可以用于筛选小亚璃眼蜱唾液腺酵母双杂交c DNA文库,获得可能与环形泰勒虫TRAP-A蛋白相互作用的蜱源蛋白。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2020,(6)
旨在基于鸡胚外泌体及所含有的miRNAs解析其产生生理功效的活性物质基础及作用机制。本研究收集13胚龄惠阳胡须鸡胚蛋18枚(3组,每组6枚),采用酶消化、蔗糖密度梯度和差速超速离心等方法分离鸡胚组织来源的外泌体,经透射电镜、纳米流式和标志蛋白流式检测等方法鉴定其特征。利用高通量测序方法研究外泌体样本中miRNAs表达谱,对各样本top 10且共表达的miRNAs进行靶基因预测与功能分析。结果表明,分别获得了3个浮力密度范围(S1:1.13 g·mL~(-1)、S2:1.21 g·mL~(-1)和S3:1.32 g·mL~(-1))具有外泌体典型特征的胞外囊泡;与miRBase V21进行比对发现,S1、S2和S3样品中分别含有675、661和845个已知的miRNAs,这些miRNAs中有488个(52.6%)三者共有,包括了广泛参与细胞增殖、分化和免疫应答等过程的功能性miRNAs。TargetScan 7.2和miRDB预测得到3个样本中top 10且共表达的56个miRNAs的靶基因,获得的3 650个靶基因经DAVID分析,显著富集了24个与机体生长、发育、免疫等有关的生物学通路(P0.05),包括MAPK信号通路、mTOR信号通路、Notch信号通路、Wnt信号通路和GnRH信号通路等。本研究建立了鸡胚组织中有效分离外泌体的方法,发现鸡胚组织来源的外泌体miRNAs会影响机体生长发育和免疫调节有关的生物学通路。 相似文献