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1.
农杆菌介导春小麦遗传转化体系的优化研究 总被引：3，自引：1，他引：2
采用携带GUS基因双元表达载体p1301-Pubi-Ecppc的根癌农杆菌菌株C58c1、LBA4404和EHA105对4个春小麦品种的幼胚愈伤组织进行了遗传转化。结果表明,3M1.5为最佳诱导培养基;扬麦158和扬麦10是用于小麦遗传转化的良好基因型。对农杆菌转化条件进行进一步优化,得出用农杆菌C58c1侵染预培养15d的扬麦158幼胚愈伤组织,当侵染液浓度为OD6000.8、侵染40min、共培养3d时,可以提高农杆菌介导小麦遗传转化的筛选频率和PCR阳性率。对所得到的具有hyg抗性的愈伤和抗性植株进行GUS基因化学组织检测和PCR分子鉴定,初步证明Ecppc基因已整合到小麦再生植株基因组中。本研究初步建立了农杆菌介导小麦的遗传转化体系。 相似文献
2.
农杆菌浸种法介导中华结缕草遗传转化体系的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
以中华结缕草萌动种子为转化受体,利用NPT-Ⅱ筛选基因对影响农杆菌介导的遗传转化外部因素进行探索,通过优化转化条件,建立了农杆菌浸种途径介导的中华结缕草遗传转化体系。结果表明：利用催芽6-7d的种子,加入OD600值为0.9的农杆菌浸染菌液（在浸染菌液中添加100μmol.L-1乙酰丁香酮）,附加5min+30s真空处理,振荡浸染48h,共培养3d后,用75mg.L-1卡那霉素筛选能够获得较好的转化效果。通过对卡那霉素抗性苗进行PCR检测和GUS组织化学染色,初步验证NPT-Ⅱ和GUS基因已经整合进植物基因组,阳性转化率为55.21%。 相似文献
3.
根癌家杆菌介导的玉米遗传转化体系的建立 总被引：47，自引：0，他引：47
用根癌农杆菌菌株LBA4404（pTOK233)转化多种基因型的玉米幼胚。幼胚与农杆菌共培养3d后，检测到了GUS基因的瞬时表达。利用GUS基因的瞬时表达对农杆菌转化玉米的条件进行了优化，共培养后的幼不经含潮霉素的培养基筛选培养两个月后，获得了多种基因型的抗性愈伤组织。其中综3自交系的抗性愈伤组织分化出植株，P9－10、综3自交系R0结实得到后代。Southern杂交分析证实了霉素基因在玉米自交系P9－10基因组中的整合，建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。 相似文献
4.
农杆菌介导的花生遗传转化体系的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
以花生胚小叶及其诱导形成的愈伤组织为转化受体,采用农杆菌介导法,通过评估外植体GUS基因瞬时表达率,优化花生遗传转化条件。结果表明,侵染液中添加表面活性剂2-氮吗啉乙烷磺酸(MES)150mg/L或烟草提取物0.5ml/30ml有利于提高胚小叶外植体GUS瞬时表达率;采用针刺法辅助农杆菌介导转化,其胚小叶外植体多点GUS瞬时表达率(29.1%)明显高于未针刺的对照(12.1%);利用愈伤组织作为转化受体,其多点GUS瞬时表达率高达70.1%。利用此优化体系进行花生遗传转化,获得的抗性苗2011年经嫁接、移栽于试验田,PCR检测获得了T0代转基因植株,2012年部分T1代植株也检测出目的条带。 相似文献
5.
为建立根癌农杆菌介导的草莓褪黑素基因高效遗传转化体系,以草莓品种“早红”叶片和叶柄为外植体,优化了影响根癌农杆菌遗传转化的因素,包括农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间和预培养时间等,建立了适宜草莓“早红”的农杆菌遗传转化体系。结果表明,“早红”草莓适宜的转化条件是：外植体的最适预培养时间为2～3 d,农杆菌侵染的最佳菌液浓度为OD600 0.3～0.5,最适侵染时间为15 min,最适共培养时间为3 d。在此基础上,通过根癌农杆菌介导法将褪黑素合成关键酶N -乙酰转移酶（AANAT）和羟吲哚-氧甲基转移酶（HIOMT）基因AANAT和HIOMT转入草莓基因组,并对获得的抗性植株进行PCR和PCR-Southern blot检测分析,结果表明外源基因已经整合进草莓基因组中。RT-PCR分析证明外源基因已经在转录水平表达。 相似文献
6.
本研究采用农杆菌介导法将KN1基因遗传转化小油桐,并获得了转基因植株。在研究中分析了农杆菌菌液菌液的浓度、侵染时间和外植体的大小对遗传转化效率的影响以及KN1基因超量表达对转基因植株再生的影响。研究结果表明：以苗龄15d左右的小油桐无菌苗子叶为外植体,农杆菌菌液浓度OD600为0.6～0.8时,侵染8min,外植体大小为（0.8×0.8）～（1.0×1.0）mm时,遗传转化效果最好;对抗性芽及再生植株进行GUS及PCR检测结果表明,KN1基因已经整合到小油桐植物基因组中。KN1基因的超量表达可提高小油桐再生芽分化,影响转化芽及植株的外观形态及叶片的表型,包括芽及植株矮小,茎杆粗壮;叶片缩小,边缘分裂,对称性丧失,无子叶柄等。 相似文献
7.
邓向阳 《广西农业生物科学》2010,(4):754-760
农杆菌介导的转基因法是目前玉米遗传转化的主流方法之一。目前,模式玉米种质幼胚的转化体系已程式化,且开发了新筛选基因和获得不含筛选基因转基因玉米的方法,但是大多数育种骨干自交系转化频率低和转化受体基本上是幼胚。从农杆菌、受体及培养条件多方面各种因素对问题进行分析,多数研究认为针对特定基因型和受体材料建立好的受体再生系统,结合高效率农杆菌转化体系,获得多目的基因聚合（无其它外源片段）的转基因玉米将是农杆菌介导玉米转化体系研究的最终目标。本文主要从农杆菌介导（转基因）法应用于玉米遗传转化的历史、现状、问题等方面进行综述,为同领域的研究者提供一定的参考。 相似文献
8.
为验证从狗蔷薇类原球茎克隆的RaWUS基因的功能,构建了组成型表达载体,并用根瘤农杆菌介导的叶盘转化法对烟草进行了遗传转化。通过除草剂草丁膦筛选,获得了转基因植株并对其进行了表型观察和RT．PCR分析。结果显示转基因烟草叶片形态和叶脉表现出形态变化,包括叶片浅裂、叶片边缘波浪状、叶脉紊乱,甚至叶片的主脉上有不定芽的产生等。RT-PCR分析表明,RaWUS基因仅仅在经过草丁膦筛选的抗性转基因烟草中强烈表达,在野生型烟草中没有表达。表明RaWUS基因已经被成功转入烟草中,并可能通过改变激素的水平和调控维管束的发育来影响叶片形状。 相似文献
9.
利用蔷薇科植物基因5'UTR快速扩增狗蔷薇RcPIN1和RcPLT的5’末端 总被引：1，自引：0，他引：1
狗蔷薇不定根可被噻苯隆(TDZ)高效诱导形成类原球茎,深入探讨其诱导阶段的分子生物学机制,有利于指导切花月季建立类似高效再生和遗传转化体系.快速、准确克隆和筛选狗蔷薇类原球茎发生的关键基因是进行分子生物学水平研究的一个重要前提.利用苹果(Malus×domestica)、桃(Prunus persica)和草莓(Fragaria vesca)高同源性基因5'UTR(非翻译区)的相对保守性,在其内保守区域设计上游简并引物,以M-MLV逆转录酶反转录合成cDNA为模板,直接扩增蔷薇科植物狗蔷薇(Rosa canina)RcPIN1(pin-formed)和RcPLT(plethora)基因5’末端,大大减少了获取众多目的基因全长的时间及成本.结果显示,在狗蔷薇RcPIN1和RcPLT基因与其对应苹果、桃和草莓高同源性基因的5'UTR内,很多区域表现出较高保守性,表明在5'UTR相对保守区域设计上游简并引物扩增目的基因5’末端的合理性.与常规5'CDNA末端快速扩增技术(5’RACE)相比,本方法无需对cDNA模板5’末端加尾同聚物和引入锚定引物,即不必使用昂贵的5’RACE试剂盒,具有快捷、节约等优点,是一种获取蔷薇科植物基因5'末端的可行途径. 相似文献
10.
为建立高效的棕色棉茎尖遗传转化体系,以陆地棉棕彩选1号为材料,采用农杆菌介导茎尖的遗传转化方法,以培养7 d的棕彩选1号幼苗茎尖为受体,设计正交试验对共培养时间、共培养温度、菌液OD600、侵染时间等条件进行优化;此外,还研究了受体茎尖的大小及真空渗透等因素对转化效率的影响,初步建立了棕色棉茎尖农杆菌介导的遗传转化技术体系。结果表明,带有0.5 cm下胚轴的茎尖适合转化,适宜的农杆菌介导遗传转化条件为农杆菌菌液浓度OD600=1.0,侵染时间20 min,共培养时间3 d,共培养温度24℃。此外,真空渗透处理有助于抗性苗的发生。再生植株经在含100 mg·L~(-1)卡那霉素的培养基上筛选,获得102株抗性植株,再进行PCR鉴定和Southern杂交检测,共获得24株转基因植株,转化率为0.4%,且为单拷贝基因插入。本试验建立的优化条件为棕色棉的遗传转化奠定了理论基础。 相似文献
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为了优化根癌农杆菌介导的棉花下胚轴切段的基因转化体系,以苜蓿抗菌肽基因（alflafa antifungul peptide gene, alfAFP）为目标,利用GUS报告基因和潮霉素抗性基因的检测方法,分析和探讨了根癌农杆菌菌种、菌液浓度、浸染下胚轴的时间、共培养中乙酰丁香酮（AS）的浓度、共培养温度和时间等因子对基因转化的影响。优化分析表明,用农杆菌菌株LBA4404当OD600值为0.5-0.7的菌液浸染5-7日龄的棉花无菌苗下胚轴切段10-15分钟,在含200µmol/L AS的共培养基中21℃暗培养60h可更有效地提高转化率。经上述条件处理的下胚轴在含50mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上培养3周可产生转化率最高的愈伤。愈伤组织经分化培养获得15株再生棉花,经过PCR和southern-PCR分析,发现其中12株含有外源抗病基因alfAFP,可作为棉花抗病育种的种质。 相似文献
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埃及伊蚊TMOF同源基因表达载体构建及烟草转化 总被引：2，自引：2，他引：0
胰蛋白酶调节抑制因子（Trypsin-modulating oostatic factor, TMOF）可以有效地抑制昆虫中肠胰蛋白酶的活性。本文为了研究埃及伊蚊TMOF同源物基因在转基因植物广谱抗虫中的作用,利用人工合成的Aea-TMOF同源物基因,以改造过的pCAMBIA1301质粒为基本载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动Aea-TMOF基因的植物表达载体pCAMBIA1301+ Aea-TMOF。然后,采用冻融法转入农杆菌LBA4404菌株,通过叶盘法对烟草进行了遗传转化。经PCR和GUS染色检测,Aea-TMOF同源物基因已整合到烟草基因组中。 相似文献
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根癌农杆菌介导苜蓿遗传转化体系的建立 总被引：19，自引：0，他引：19
以建立的苜蓿高频再生体系为基础，利用GUS染色组织分析法，研究了影响根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens Conn)LBA4404菌株介导的苜蓿（Medicago sativa L)遗传转化的若干因素，建立了苜蓿快速有效的遗传转化体系，获得了转BADH基因植株。苜蓿的不同基因型、附加乙酰丁香酮的浓度、预培养与否、菌液浓度、共培养时间和卡那霉素浓度等对转化频率都有一定影响。最高转化频率可达43.3％，抗性植株经PCR和PCR-Southern blot检测表明，目的基因已整合进苜蓿基因组中。 相似文献
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正交设计在杨树最佳遗传转化体系的建立 总被引：5，自引：2，他引：3
本试验以建立的南林95杨高频再生体系为基础,利用正交试验设计,通过GUS组织染色分析法研究了预培养时间、菌液浓度、AS浓度、侵染时间和共培养时间5个因素在4个水平上对南林95杨遗传转化的影响,并探讨了南林95杨转化中添加卡那霉素(Kanamycin)的适宜浓度。结果表明:外植体预培养7d,在含乙酰丁香酮AS200μmol/L、菌液浓度OD值为0.6的农杆菌液中侵染20min,共培养3d为最佳遗传转化体系,适宜的卡那霉素筛选浓度为50mg/L;经GUS染色检测和PCR分析表明,GUS基因已初步整合进南林95杨基因组中。 相似文献
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本研究以优良玉米自交系交51为材料,通过农杆菌介导的茎尖转化将海藻糖-6-磷酸合成酶基因TPS1和葡萄花青素调控基因VlmybA2转入玉米中。确立了最佳的除草剂Basta筛选浓度,研究了不同真空渗透压、农杆菌液浓度、侵染时间等因素在转化过程中对玉米植株存活率的影响。结果表明80 mg/L除草剂Basta为最佳筛选浓度,真空渗透压为60 kPa、农杆菌液浓度OD600为0.8、侵染时间为8 min时是最佳转化条件,经过GUS组织化学染色和PCR检测,证明TPS1基因和VlmybA2基因已经整合到玉米基因组中。 相似文献
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综述油菜遗传转化中再生体系的建立、农杆菌侵染方法、适宜菌株及载体选择等方面的研究进展,并对转化中寄主基因型、目的基因及其启动子的选择、筛选方法、外源基因稳定性等方面存在的问题进行了分析与讨论,为优化油菜等芸薹属的遗传转化提出可行性建议. 相似文献
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发根农杆菌介导转化小金海棠的影响因素 总被引：2，自引：1，他引：1
为了研究发根农杆菌介导的小金海棠的遗传转化体系,采用农杆菌侵染的方法,对影响Ri质粒诱导小金海棠产生发状根的各种因素进行了研究,结果发现,Ri质粒转化小金海棠形成发状根的效率,受发根农杆菌种类、浓度、生理状态及小金海棠外植体的种类、外植体在菌液中的侵染时间、共培养时间、基本培养基等多种因素的影响,加入20mg/L AS对转化效率影响不大。采用稀释5倍的处于对数生长期的8196菌株,感染小金海棠无菌苗幼嫩叶片5-10min,在MS培养基上共培养2d后转入含卡那霉素10mg/L、头孢霉素250mg/L的1/4MS诱导培养基上培养一个月,发根诱导效率最高可达93.3%.随机选择50条诱导的发根进行GUS染色,结果发现有96%发根GUS染色呈阳性。对48条GUS阳性的发根进行PCR检测,其阳性率为100%。高效的发根诱导体系为发根的进一步再生及转入外源基因奠定了基础。 相似文献
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为建立和优化节瓜的遗传转化体系,并高效地完成CqWRKY1基因的遗传转化,本研究以节瓜A39为材料,通过RT-PCR技术克隆了节瓜CqWRKY1基因,采用Gateway同源重组法构建了pEarleyGate101-CqWRKY1超表达载体,以节瓜子叶节为外植体,利用农杆菌介导的遗传转化法进行转化。结果表明,子叶节不定芽诱导的最适培养基为MS+0.5 mg·L~(-1)6-BA+1 mg·L~(-1)ABA,诱导率可达76.17%;生根的最佳培养基为1/2MS+0.5 mg·L~(-1)IAA;农杆菌侵染的最佳条件为农杆菌浓度OD_(600)为0.3、侵染时间为10 min、共培养时间为3 d;最佳的抑菌抗生素为500 mg·L~(-1)的头孢霉素。本研究在181株拟转基因组培苗中共得到76株阳性T_0转基因组培苗,其中共有37株移栽成活。PCR结果表明,CqWRKY1已成功整合到37株转化植株的基因组中。本研究结果为进一步研究CqWRKY1基因的功能奠定了一定的理论基础。 相似文献
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玉米In5-2启动子功能区域在洋葱瞬时表达系统中的分析 总被引：3，自引：0，他引：3
本研究旨在通过对根癌农杆菌侵染洋葱表皮细胞的条件进行优化,从而建立一种新的瞬时表达系统,并将其应用于玉米In5-2启动子的功能区域的分析中,明确In5-2启动子的乙酰苯胺类化合物诱导元件的具体位置.在本研究中采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染洋葱(Allium cepa)表皮细胞,对转β-葡糖醛酸酶(GUS)基因的瞬时表达进行研究,并分析了侵染液中乙酰丁香酮(As)的浓度、侵染时间、菌液浓度、共培养时间对GUS基因的瞬间表达的影响.结果显示,在OD600值为0.8的农杆菌液中感染15 min,共培养3 d,能够得到较高的GUS基因瞬间表达,从而建立了一种新的瞬间表达系统.同时,构建了含不同长度的玉米(Zea mays)In5-2启动子片段缺失载体,利用新的瞬时表达系统分析其功能区域,推测出乙酰苯胺类化合物诱导元件位于ATG上游-220～-143 bp之间.结果表明新的瞬时表达系统可以快速有效地进行启动子的分析. 相似文献