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1.
甜瓜蔗糖磷酸合成酶基因全克隆及工程载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
蔗糖磷酸合成酶在甜瓜果实蔗糖合成途径中起关键性的调节作用,克隆该基因并导入甜瓜低糖自交系,可改良甜瓜果实品质创新优良种质。从甜瓜幼苗叶片提取总RNA,利用RT-PCR与Southern blot方法相结合,重组子质粒经限制性内切酶酶切和PCR验证以及测序同源性比较,克隆到基因的5’(2859bp)和3’(852bp)。应用高保真Taq聚合酶PCR拼接蔗糖磷酸合成酶完整cDNA序列3692bp,该片段与GenBank中其它植物基因序列具有97%￣99%的同源性,登录号DQ364058。应用BamHⅠ、KpnⅠ、BglⅡ限制性酶切获得植物双元表达载体pROK2及基因的线性片段,通过T4连接酶反应,构建了以CaMV35S为启动子,以Tnos为终止子的工程载体pROK-SPS,该载体含有Npt-II选择标记基因。 相似文献
2.
牡丹ACC氧化酶基因的克隆与反义载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
根据报道的牡丹ACC氧化酶基因(DQ337251)cDNA序列,设计一对特异引物,以牡丹品种"洛阳红"基因组DNA为模板,用PCR扩增方法克隆出牡丹ACC氧化酶基因的部分片段,并将其连接到pMD18-T载体上进行测序.结果表明,克隆的序列全长为467 bp,其中包括一个长度为157 bp的序列,推测它可能是一个内含子,其它序列与已报道序列同源性为98.2%;用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒和载体pBI 121酶切、连接,构建牡丹ACC氧化酶基因的反义表达载体. 相似文献
3.
柿果ACC合成酶基因的克隆与植物表达载体的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
以柿果组织中分离的总RNA为模板,经RT-PCR扩增到约1.1 kb的富有柿果ACC合成酶(Fuyu-ACS)的 基因片段,将此片段克隆到pGEMR-T easy vector上,经测序分析与Genbank中平核无柿果的DK-ACS1基因核苷酸 序列的同源性为99％。设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ACS- Fuyu片段。2个片段经双酶切消化后,分别以正反2个方向插入到植物表达载体pBI121的35 S启动子和NOS终止 子之间,构建成Fuyu-ACS基因的植物表达载体。 相似文献
4.
八氢番茄红素合成酶是番茄红素合成的关键酶,通过PCR法获取PSY2基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pBI101.2中,构建了果实特异表达启动子的八氢番茄红素合成酶基因植物表达载体。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定。结果表明,番茄果实特异性表达PSY2蛋白的重组质粒构建成功;通过农杆菌直接转化技术将其成功转入转化农杆菌LBA4404、EHA105,为下一步PSY2蛋白在番茄果实中特异表达奠定了基础。 相似文献
5.
MYB转录因子是植物转录因子中最大的家族之一,在转录调节中起着多方面的重要作用。实验利用RACE技术从野生红肉苹果(Malus pumila var.niedzwetzkyana Schneid.)中获得了MpMYB30的全长序列,利用生物信息学的方法对其蛋白进行了分析和预测并将其连接到pCAMBIA-S1300+植物表达载体中。结果表明,该基因全长为1661bp,推导的氨基酸序列经系统发育分析与葡萄MYB30及蓖麻MYB基因相似性最高,命名为MpMYB30,其N端含有2个约55个氨基酸组成的MYB特征结构域。该基因推导的MpMYB30蛋白的分子式为C1790H2794N538O584S12,相对分子质量为41579.8ku,等电点为6.30,不存在信号肽和跨膜区域,蛋白质结构以α螺旋为主。利用XbalⅠ和SacⅠ对重组质粒进行酶切,并将其连接到pCAMBIA-S1300+载体上,通过抗性筛选和PCR酶切检测,证实了MpMYB30基因已经构建到植物表达载体pCAMBIA-S1300+上。 相似文献
6.
拟南芥花期基因FT转化切花菊‘神马’ 总被引：3，自引：2，他引：1
采用RT-PCR方法从拟南芥叶片中克隆FT基因,经过测序分析、酶切之后,连接到植物表达载体Super1300+,构建植物重组载体FT-Super 1300+,运用农杆菌介导法将FT基因导入切花菊'神马'中,鉴定其在转化植株体内的整合和表达.扩增得到的基因片段经测序分析与GenBbank上的FT基因同源性为100%;构建的植物表达载体经过酶切分析证实外源基因已经正确插入;转化后得到了29株抗性植株,PCR和PCR-Southern杂交结果显示,8株抗性植株为阳性,说明外源基因整合到转化植株的基因组中.RT-PCR鉴定结果表明外源基因在转化植株叶片中表达.其中转FT基因的一个株系在组培条件下分化出花芽,表明转基因植株花芽分化不受光周期影响,花期可以提前. 相似文献
7.
拟南芥花期基因FT 转化切花菊‘神马’ 总被引：3，自引：0，他引：3
采用RT-PCR 方法从拟南芥叶片中克隆FT 基因,经过测序分析、酶切之后,连接到植物表达载体Super1300+,构建植物重组载体FT- Super1300+,运用农杆菌介导法将FT 基因导入切花菊‘神马’中,鉴定其在转化植株体内的整合和表达。扩增得到的基因片段经测序分析与GenBbank 上的FT 基因同源性为100%;构建的植物表达载体经过酶切分析证实外源基因已经正确插入;转化后得到了29 株抗性植株,PCR 和PCR-Southern 杂交结果显示,8 株抗性植株为阳性,说明外源基因整合到转化植株的基因组中。RT-PCR 鉴定结果表明外源基因在转化植株叶片中表达。其中转FT 基因的一个株系在组培条件下分化出花芽,表明转基因植株花芽分化不受光周期影响,可以提前花期。 相似文献
8.
以伏令夏橙叶片中分离的总RNA为模板,经RT-PCR扩增到一条约600bp、含钙离子结合蛋白基因(CsCaBP)的片段,将此片段克隆到pMD-19T中,经测序分析该片段与甜橙基因组中的对应序列完全吻合。设计2对带有限制性内切酶位点的特异性引物,以cDNA为模板扩增到2个CsCaBP片段,并连接到TA克隆载体pMD-19T上;经双酶切消化后,分别以正反2个方向插入到植物表达载体pFGC5941的查耳酮合成酶(CHSA)内含子两侧,构建成功CsCaBP的RNA干扰载体,但未获得转基因植株。将CsCaBP的正向片段定向克隆到具有CaMV35S启动子的pF-GC5941表达质粒上,构建成功CsCaBP过量表达载体。将构建好的表达载体导入根癌农杆菌LBA4404菌株,转化酸橙下胚轴,经PCR检测,获得9株过量表达转基因植株,荧光定量PCR验证发现目的基因在转基因植株中有不同程度的表达。 相似文献
9.
应用RNA反义技术抑制甜瓜果实发育过程中酸性转化酶活性,促进蔗糖积累,从而为培育优质品种提供了可行的新方法。将已克隆到pMD18-T载体上的甜瓜酸性转化酶基因用BamHⅠ和HincⅡ双酶切,得到该基因编码区1038bp的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的BamHⅠ/SmaⅠ克隆位点,构建了甜瓜酸性转化酶cDNA反义表达载体(Anti-MAI1)。采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。利用叶盘法转化烟草,经PCR和PCR-Southern杂交检测,证明此基因已整合入烟草的核基因组中。 相似文献
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小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因植物表达载体的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV)是危害中国葫芦科作物主要病毒之一。试验以该病毒中国分离物外壳蛋白基因的克隆载体pZCP-87(含ZYMV的CP基因)为材料,经SalⅠ和BamHⅠ双酶切,从胶上回收目的基因,与经过同两种酶酶切的植物表达载体pBIN438连接,转化感受态的大肠杆菌细胞,提取质粒,经PCR和SalⅠ/BamHⅠ双酶切验证,已将该病毒外壳蛋白基因克隆到植物表达载体上(重组质粒命名为pBZCP5),采用冻融法完成了对pBZCP5质粒的农杆菌转化。该工作是通过转基因获得抗ZYMV病毒研究的基础。 相似文献
11.
用限制性内切酶从目的基因供体质粒pBI-aPG上切下大小约2.3kb的目的基因,将它定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,构建成含有GUS基因和NPTⅡ基因的甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体pCB-aPG。采用直接转化法将pCB-aPG导入根癌农杆菌菌株LBA4404,采用该菌株对普通烟草进行了遗传转化研究。在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过GUS基因组织化学法检测以及PCR方法鉴定,证实了该反义基因已导入烟草基因组中。此项研究为下一阶段用该反义基因转化甜瓜品种以改良甜瓜果实耐贮运性打下基础。 相似文献
12.
AIM: To provide experimental evidence for gene therapy of thrombophilia disease, we constructed the eukaryotic expression plasmid with human thrombomodulin (hTM) gene and observed the alteration of hTM expression on the surface of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) with and without the reconstructive plasmid. METHODS: The whole expressive fragment of hTM gene was amplified by PCR from human genome. Both hTM gene and pcDNA3.1(+)/neo empty vector was digested by HindⅢ and EcoRⅠ. Two digested fragments were ligated into pcDNA3.1/hTM with T4DNA ligase. After identifying, the reconstructive plasmid transfected into HUVECs using lipofectin. The hTM antigen on the HUVECs was detected by immunohistochemistry. RESULTS: The hTM reconstructive plasmid was confirmed by double endonuclease redigesting and sequencing. About 10% HUVECs were transfected by pcDNA3.1/hTM plasmid with lipofectin and the high-level hTM was detected on the transfected cells. CONCLUSION: We constructed the pcDNA3.1/hTM plasmid successfully, and it could be expressed on the HUVECs. 相似文献
13.
从莲种子发育中期胚cDNA文库中克隆得到的防御素基因cDNA全长561bp,GenBank登录号为EF421192。分析发现该基因234bp的开放读码框编码77个氨基酸的多肽序列,除信号肽序列外与其它不同来源的植物防御素基因有较高同源性,将其命名为NnDefensin。NnDefensin蛋白带有30个氨基酸的信号肽,具有8个半胱氨酸的高度保守结构等典型的植物防御素特征,成熟肽部分含有γ–硫素蛋白功能结构域。在系统进化上NnDefensin与单子叶植物中的粳稻和小麦的同源蛋白,以及车前草同源蛋白亲缘关系较为接近。通过PCR扩增克隆莲胚防御素基因片段并连接到载体pBI121和带有花生油体蛋白种子特异启动子的载体pAhOleo17.8︰GUS中,成功构建了35S启动子控制的植物表达双元载体pBI121-NnDef和种子特异表达双元载体pAhOleo-NnDef,为该基因的功能鉴定及通过基因工程方法提高转基因植物以及种子的抗病能力奠定基础。 相似文献
14.
AIM:To construct a eukaryotic expression vector expressing outer membrane lipoprotein LipL41 of Leptospira lai and express it in mammalian cell. METHODS:LipL41 gene was amplified by PCR from genome of Leptospira lai 017 strain, and was subcloned into vector pGEX-4T-1. After sequencing, LipL41 gene digested by restriction endonuclease and cloned into vector pcDNA3. After confirming the correctness of the eukaryotic recombinant vector by restrication enzyme digestion, it was transfected into COS7 cells by liposome. Its expression was analyzed by RT-PCR. RESULTS:A fragment of 1 011 bp was amplified, and sequence analysis showed it had a 98% homology with Leptospira kirschneri. The analysis of restriction enzyme indicated that the eukaryotic recombinant vector was correctly constructed. A specific amplified fragment was showed in the cells transfected with recombinant plasmid by RT-PCR, but the cell transfected with blank plasmid did not show this band. CONCLUSIONS:The LipL41 gene of Leptospira lai was successfully inserted into eukaryotic expression plasmid and the recombinant plasmid expressed the LipL41 mRNA. 相似文献
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利用PCR技术,以毛尖紫萼藓总RNA为模板,扩增出上、下游分别加入BamHI、SacⅠ酶切位点的GH394(657 bp)基因CDS区全长序列,采用pMD18-T Vector、pRI 101-AN Vector构建了该基因克隆、表达载体,并将重组载体质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)DH 5α和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)工程菌株GV3101中,并选用X-gal、IPTG和利福平(Rifampicin,Rif)、卡那霉素(Kanamyein,Km)筛选阳性菌株。结果表明:已成功构建pMD-GH394克隆载体和pRI 101-AN-GH394表达载体并将重组质粒转入目的菌株中;该试验为后续实现毛尖紫萼藓GH394基因抗旱预期功能的验证,奠定了良好的试验基础。 相似文献