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1.
[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1 821～+61 bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1 882 bp的片段,并构建了9个pGL3-mGH promoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110 bp以内,启动子区-218～-110 bp和-429～-218 bp间存在正向调控元件。 相似文献
2.
【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763~-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763~-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。 相似文献
3.
【目的】对鸭CD8α基因启动子活性区域进行分析,为鸭CD8α基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】利用前期基因组步移技术获得的鸭CD8α基因的启动子区序列,制备一系列启动子缺失突变体（-625/-1 bp,-1 110/-1 bp,-1 413/-1 bp,-2 151/-1 bp）,定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic 中,构建荧光素酶报告基因重组载体,采用 Lipofectamine 2000 将重组质粒瞬时转染DT40细胞,分析CD8α基因启动子系列缺失突变体在细胞内的转录活性。【结果】鸭CD8α基因 5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,-1110--625启动子活性最强,且-625--1和-625--1 110 bp区域均存在正调控元件。【结论】成功构建了荧光素酶报告基因真核表达载体,确定了鸭CD8α基因调控区,为进一步研究其转录调控机制奠定了基础。 相似文献
4.
【目的】研究犬CREBZF启动子对4种氨基酸(谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸和蛋氨酸)缺失的应答效应。【方法】通过PCR和双酶切方法,从犬全血基因组中扩增5′侧翼区1 767bp的DNA片段,对其进行克隆测序分析后,构建全长及系列包含不同长度CREBZF启动子的表达载体,用Quikchange试剂盒构建了CREBZF启动子定点缺失载体,转染MDCK细胞24h后,用双荧光素酶报告系统检测在氨基酸缺失条件下表达载体的双荧光素酶活性。【结果】扩增到了犬CREBZF 5′侧翼区1 767bp的启动子序列,并成功构建了包含不同长度CREBZF启动子的荧光素酶报告基因表达载体pGL3-ZF-A,pGL3-ZF-B,pGL3-ZF-C,pGL3-ZF-D,pGL3-ZF-E,pGL3-ZF-F;其中pGL3-ZF-A(-1 767→+1bp)能够应答4种氨基酸缺失;定点缺失结果显示,当缺失亮氨酸时,-1 227→-1 219bp序列(5′-ATTCACTCA-3′)的缺失可使CREBZF的转录活性完全丧失,该序列与已知的其他氨基酸应答元件(Amino acid re-sponse element,AARE)的同源性达89%。【结论】5′-ATTCACTCA-3′是犬CREBZF启动子中应答氨基酸应激必不可少的调控元件。 相似文献
5.
《江苏农业学报》2015,(5)
本研究旨在分析猪RELMβ基因启动子结构,初步探索RELMβ基因表达调控机制。通过PCR方法扩增RELMβ基因的系列启动子缺失片段并分别克隆到荧光素酶报告基因表达载体p GL3-Enhancer中,经酶切、测序和生物信息学分析,构建包含RELMβ启动子系列截短的荧光素酶报告基因重组质粒,脂质体转染至HT29和293T细胞,应用双荧光素酶活性检测系统检测启动子活性。试验获得了猪RELMβ基因约1 kb的启动子序列,序列比对发现猪和人物种间相似性仅34.9%,猪和小鼠的同源性是82.4%。生物信息学分析预测猪RELMβ基因转录起始位点在-556 bp处,猪和人RELMβ基因启动子存在系列保守的转录因子结合位点,包括Cdx2、SRY、NFKB、NKX-2、c-Myb、GATA-1、GATA-3、C/EBP、MZF1等。细胞检测结果显示,p GL-RELMβ(-574~+215)活性最强,推测在-574~-182 bp位点之间存在RELMβ基因启动子的关键顺式调控元件,这一区域发现SRY、Cdx2、GATA-1和MZF1等关键转录因子结合位点。 相似文献
6.
旨在确定小鼠DAZL启动子基本活性区,并分析启动子区域甲基化对其启动子活性的影响,探究小鼠DAZL的表达调控机制。采用PCR法扩增不同长度的小鼠DAZL启动子,插入到p EGFP-N1和p GL3-Basic载体,构建重组载体。将重组载体转染GC-1细胞系,并通过添加适量DNA甲基化转移酶抑制剂(5-azacytidine,5-aza-C)逆转各试验组启动子片段的甲基化水平,然后利用双荧光素酶报告基因检测系统检测DAZL活性变化。双荧光素酶活性检测结果表明,小鼠Dazl启动子基本活性区域为5’侧翼区-370~-36 bp,在-370~-166 bp区域存在不可或缺的重要调控元件;经5-aza-C处理后,各缺失片段载体转染的GC-1细胞DAZL的启动子活性与对照组相比均有不同程度的提升,但差异不显著。本试验确定了小鼠DAZL启动子基本活性区域,证明降低小鼠睾丸DAZL启动子区域甲基化水平,有助于DAZL在生殖细胞中特异性表达,为进一步探究DAZL生物学功能和调控机制提供参考。 相似文献
7.
【目的】分析山羊PRNP基因启动子活性区域,旨在筛选调节朊蛋白表达水平的关键区域或转录因子,为阐明山羊PRNP基因的表达调控提供理论依据,并为从遗传学角度降低朊蛋白病的发生提供思路。【方法】以山羊PRNP基因序列（GenBank登录号：EU870890）为模板,设计特异性引物,扩增山羊PRNP基因5′侧翼区片段,并将扩增片段克隆至pEASY-T3载体,鉴定为阳性的克隆进行测序;利用生物信息学方法和在线工具进行启动子区域和转录因子结合位点的预测;利用缺失突变技术扩增启动子区不同长度的片段11个,并克隆至pEASY-T3载体后,鉴定为阳性的质粒和pGL3-Basic载体分别用限制性内切酶Mlu I和Bgl II进行酶切,并回收酶切产物;利用T4连接酶进行目的片段与pGL3-Basic连接,鉴定为阳性的荧光素酶报告基因重组质粒进行测序,并提取无内毒素质粒,用脂质体转染法瞬时转染至SH-SY5Y细胞,转染48h后,利用双荧光素酶检测试剂盒进行各缺失突变重组质粒在细胞内的启动活性检测。【结果】成功克隆了山羊PRNP基因5′侧翼区片段,长度为2 332 bp,且该片段含有预测的启动子活性区域、保守的motifs和多个转录因子的结合位点;成功克隆了11个含有不同长度启动子的片段,并与荧光素酶报告基因连接,并构建了目的片段与荧光素酶报告基因的重组质粒;转染时脂质体与DNA的比例为1﹕0.5,萤火虫荧光素酶载体与海肾荧光素酶比例为50﹕1;山羊PRNP基因5′侧翼区存在着核心启动子,启动子活性最强的区域为-519-+82 bp,且在-220-+59 bp这一区域存在着正调控元件,外显子1对启动子活性中起重要的调控作用;4个motifs可能为正调控元件结合位点;在强启动子活性区存在10个Sp1结合位点,2个AP-2 alpha结合位点和1个AP-1结合位点;山羊PRNP基因motif 3和motif 4分别预测为转录因子Foxp3和COE 1的结合位点。【结论】确定了山羊PRNP基因启动子的核心区域（-519-+82bp）,外显子1对启动子活性起重要的调控作用。 相似文献
8.
白细胞介素11（Interleukin-11,IL-11）是白细胞介素家族的重要成员,其在伤口愈合、癌细胞迁移及免疫调控等过程中起到关键作用。为了深入研究IL-11的转录调控机制,本实验通过生物信息学分析,找出斑马鱼il-11b基因的3000bp启动子序列,经缺失处理获得2908bp、2000bp、1000bp和500bp不同片段,进行PCR扩增并与pGL3-enhancer载体重组构建pGL3-il-11b-promoter-enhancer 报告基因质粒,接着转染HEK293T 细胞,再用双荧光素酶报告基因检测系统检验其转录活性。结果显示所获的il-11b启动子序列上存在3个潜在的启动子区和7个CpG岛,潜在的转录因子结合位点包括Sp1、CACCC-binding f、Egr-1、ICSBP、c-Jun、COUP、GR、RAP1、NF-kappaB、REV-ErbA alpha、ER、RAR-alpha1、RXR-beta、SRF、Oct-1、Oct-2、Pit-1a、GCN4、HNF-1、TBP、C/EBP alpha、HNF-1C、Oct-2.1、USF等,成功扩增出il-11b不同片段启动子,重组质粒双酶切检测条带大小一致,测序比对正确,双荧光素酶检测pGL3-il-11b、pGL3-il-11b-Δ1、pGL3-il-11b-Δ2、pGL3-il-11b-Δ3、pGL3-il-11b-Δ4、pGL3-il-11b-Δ5报告基因质粒的活性分别是pGL3–enhancer空载对照组的1.94、14.92、5.33、9.11、0.75、1.32倍。该结果为研究细胞因子参与的免疫相关信号之间的调控提供了有力的研究工具。 相似文献
9.
[目的]研究了宁乡猪生长激素基因(nxGH)的克隆及其原核表达载体的构建。[方法]根据已报道的猪生长激素基因序列设计了1对特异性引物,应用RT"PCR技术从宁乡猪脑垂体中克隆了nxGH编码区序列。[结果]扩增片段全长651 bp,共编码216个氨基酸。该序列与已报道的三元和五指山猪生长激素cDNA基因核苷酸序列同源性为99.85%。将nxGH cDNA序列定向插入pET"32a原核表达载体中,成功构建重组原核表达质粒pET"GH。[结论]为下一步制备宁乡猪生长激素抗体奠定了基础。 相似文献
10.
为研究胞内氯离子通道5基因(Chloride intracellular channel 5,CLIC5)广泛参与调节细胞内的各项生理活动与生化反应,并探讨该基因自身的表达调控机制,以小鼠基因组序列为模板,利用PCR技术扩增小鼠CLIC5基因5′上游调控序列,将其插入荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中,同时采用5′侧翼区缺失的方法构建了7个缺失不同DNA片段的荧光素酶表达载体。重组质粒与海肾荧光素酶载体(phRL-TK)共同瞬时转染HEK-293细胞,经双荧光素酶报告基因活性分析后,确定CLIC5基因的核心启动子区。利用生物信息学方法预测其中转录因子结合位点及启动子区甲基化状况。结果表明,CLIC5基因启动子缺乏TATA盒,但含有典型的GC盒及其他潜在转录因子结合位点;双荧光素酶报告基因活性分析表明,CLIC5基因-329～+1、-624～+1、-917～+1和-2 230～+1区域的启动子活性较高,其中-624～+1区域的启动子活性最强。进一步分析表明,启动子区-624～-329存在负性调控元件,预测存在转录因子结合位点RXR heterodimer binding sites与GC-Box factorsSp1/GC,-420～-283范围内存在CpG岛位点。 相似文献
11.
猪生长激素cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达 总被引：3，自引：0，他引：3
用逆转录－聚合酰链式反应（RT－PCR）方法，从猪脑垂体总RNA中扩增出编码猪生长激素（GH）成熟及基因序列，定向克隆至质粒pUC18，序列分析表明，克隆的猪GH cDNA长573bp，不含信号肽序列，并在该序列之前加入一起始密码子ATG。将猪GHcDNA定向克隆至原核表达载体pBV220，构建成重组GH基因表达载体pBVpGH7。SDS－PAGE和薄层扫描分析表明：经42℃诱导，pBVpGH7在大肠杆菌中可表达一分子量约2200的特异蛋白，表达量约占细胞总蛋白的20．5％。 相似文献
12.
【目的】获得猪FAM213B基因完整mRNA和启动子序列,研究猪FAM213B基因表达,为探讨母猪妊娠的建立和胚胎发育调控机制奠定基础。【方法】通过5'RACE和3'RACE技术,获得基因完整mRNA序列,分析不同物种该基因氨基酸序列相似性;通过PCR克隆启动子区,并通过双荧光素酶报告基因载体系统转染猪子宫内膜细胞,研究其转录活性。【结果】猪FAM213B基因mRNA全长808 bp,其中5'UTR、CDS区和3'UTR长度分别为67、609(含终止密码子)和132 bp(不含poly A序列),在17~106位氨基酸之间存在硫氧还蛋白折叠结构域;与猪FAM213B基因其他2个潜在转录本相比,三者都包含硫氧还蛋白折叠结构域,但蛋白三级结构存在较大差异;猪FAM213B氨基酸序列与山羊、牛和绵羊高度相似,相似性分别为94.03%、93.03%和91.54%。克隆获得2 261 bp(-2 231/+30)的基因启动子序列,将其连接至双荧光素酶报告基因载体,转染猪子宫内膜细胞,发现获得的启动子片段能够启动下游报告基因的转录,在启动子区存在潜在的典型NFκB等转录因子结合位点。【结论】本研究获得猪FAM213B基因转录本长度为808 bp,其蛋白存在硫氧还蛋白折叠功能结构域,其启动子序列(-2 231/+30)在猪子宫内膜细胞中具有较强的转录活性。 相似文献
13.
西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因启动子的克隆及活性测定 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】克隆测定西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因（Fatty Acid Synthase,FAS）启动子的全长序列,进行活性区域分析,为奶山羊FAS基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】根据牛和人脂肪酸合酶基因启动子的同源序列以及西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因5′UTR区域,分别设计上、下游引物,以西农萨能奶山羊全血DNA为模板克隆启动子序列。依据生物信息学分析结果重设引物,将FAS启动子基因分段克隆并连接到荧光素酶表达载体PGL-3,与Psv-β-半乳糖苷酶对照载体共转染293、MCF-7细胞,进行荧光素酶活性检测和β-半乳糖苷酶的活性检测。【结果】FAS基因启动子序列全长2 640 bp,与牛、人FAS启动子序列同源性90％以上,包括数个潜在SP1、Ets、LSF等转录因子结合位点和CCAAT框、GC框。-1 040—-340 bp处可能包含启动子活性中心,通过启动子缺失片段试验将活性中心范围缩小至-721—-540 bp之间。【结论】通过克隆FAS基因启动子区域,分析表明启动子前端存在负调控元件,找出了启动子最小活性中心。 相似文献
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[目的]克隆广西巴马小型猪ANK1基因启动子,确定其活性核心区,为研究ANK1基因启动子与肉质性状的相关性及构建动物疾病模型打下基础.[方法]通过在线软件对ANK1基因启动子的转录因子结合位点进行预测,根据转录因子结合位点设计特异引物扩增不同长度的ANK1基因启动子片段,并利用双荧光素酶试剂盒检测其荧光值,以确定不同ANK1基因启动子片段的活性.[结果]发现ANK1基因启动子存在1个转录起始位点(TSS)、2个CpG岛和多个转录因子结合位点,并以此作为ANK1基因启动子的分段依据,将其分割为P638、P791、P1113、P1163、P1648、P1694、P1796和P2074等8个不同长度的目的片段.成功克隆获得的8个ANK1基因启动子片段经KpnⅠ和HindⅢ双酶切、T4真核表达载体连接、细胞转染等方法构建8个双荧光素酶重组报告基因,双荧光素酶试剂盒检测结果显示,广西巴马小型猪ANK1基因启动子在P1796片段活性最强,与其他片段存在显著差异(P<0.05).[结论]成功克隆获得广西巴马小型猪ANK1基因启动子的8个片段,且利用双荧光素酶试剂盒检测确定其核心启动子区域出现在P1796片段. 相似文献
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【目的】Sall4是一种锌指结构转录因子,对建立和维持动物多能干细胞具有重要意义。为探索猪 Sall4 的表达和转录调控机制,克隆了猪Sall4启动子,对其进行了功能验证和核心调控区的筛选。【方法】从猪基因组中克隆获得2.1 kb Sall4启动子片段,并构建相应的报告载体;将报告载体pE2.1转染不同种类的细胞,进行细胞特异性表达检测;采用实时荧光定量PCR方法,检测Sall4在猪不同组织和细胞中的表达变化;通过生物信息学方法,分析Sall4启动子上各种关键顺式作用元件和潜在的转录结合位点;将多能转录因子Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Esrra/b和Smad与Sall4启动子共转染293T细胞,利用双萤光素酶报告系统检测Sall4启动子活性;采用DNA片段缺失的方法,构建一系列Sall4启动子片段缺失报告载体,将缺失片段载体分别转入293T细胞中,并利用双萤光素酶报告系统检测启动子的活性。【结果】Sall4在多能干细胞、生殖细胞和癌化肿瘤细胞中：包括P19、293T、CHO和Hela等细胞中特异性高表达。另外,通过实时荧光定量PCR检测结果显示,Sall4的表达具有明显的组织特异性,其在猪iPS细胞和生殖相关组织,如睾丸和卵巢组织中表达最高,而在脑、心、肝和肌肉等组织中的表达较低,表明该基因与细胞多能性维持具有互作关系。应用JASPAR和GPMiner软件分析发现,Sall4启动子上有TATA box、GC box、CAAT box等顺式作用元件,以及Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Esrra/b、Stat3和Smad等多能转录因子的预测结合位点。其中,Oct4、Sox2和TGF-beta信号通路因子对Sall4启动子活性有较显著的激活作用,与对照组比较Sall4启动子活性提高了3倍;而Klf4因子对Sall4启动子活性有一定的抑制作用。采用分段PCR的方法,对2.1 kb启动子进行了片段缺失,分别构建了pL2.1、 pL1.0和pL0.5等3个报告载体,检测结果发现,在pL2.1与pL1.0之间相差1 kb左右,但是启动子的活性没有显著差异。载体pL1.0与pL0.5之间多了486 bp片段,启动子活性提高了1倍多。另外,pL0.5的启动子活性与对照组比较提高了8倍。这些结果表明,猪Sall4启动子在-367 至-852 bp和-1 至-366 bp两个区域内存在核心调控区。【结论】克隆了猪Sall4启动子,证明Sall4的表达具有明显的组织特异性;Sall4启动子序列上存在众多潜在的转录因子结合位点和启动子核心调控域,是参与调控 Sall4 表达的重要序列,这些转录因子与Sall4相互作用对Sall4在多能细胞中的表达调控发挥重要作用。 相似文献
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为了探索山葡萄CBF3基因(VaCBF3)对杨树的遗传转化的影响,及组成型启动子和诱导型启动子对转基因植株生长的影响,分别构建由2种类型启动子调控的植物表达载体.根据GenBank上公布的rd29A基因序列设计特异性引物,利用PCR方法从拟南芥基因组DNA中克隆rd29A基因启动子片段,利用限制性内切酶通过酶切、连接构建由组成型启动子35S和诱导型启动子rd29A基因启动子驱动的VaCBF3基因植物表达载体,利用冻融法完成重组质粒对根癌农杆菌LBA4404的转化.试验结果表明,所克隆的rd29A基因启动子片段序列分析表明该启动子片段长度为945bp,与GenBank中基因序列同源性达99％,具有DRE、ABRE、TATAbox和CAAT box4个完整的顺式作用元件,具有启动子功能.经过酶切、连接成功地将目的基因与载体质粒连接,并将重组质粒导入至根癌农杆菌LBA4404中,为下一步利用农杆菌介导法对杨树的遗传转化及研究2种启动子的启动效率奠定了一定的基础. 相似文献
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[目的]了解广西草龟生长激素(GH)基因全序列结构特点及其与其他物种间的关系,为进一步研究GH基因的结构、功能、遗传变异规律及其与生产性能的关系提供科学依据.[方法]根据GenBank上已公布的黄喉拟水龟GH基因序列设计合成9对特异性引物,以广西草龟基因组DNA为模板进行PCR扩增,所获得目的片段经纯化、克隆、鉴定和测序后,用Vector NTI Advance 10软件将各扩增序列拼接,获得草龟生长激素基因全序列,并用DNASTAR软件MegAlign程序中的Alignment Report和NCBI的BLAST对草龟GH基因全序列进行同源性比对分析及构建基于GH基因编码序列的物种间亲缘进化树.[结果]广西草龟GH基因全长8538 bp,与黄喉拟水龟GH基因全长8517 bp相比,二者的同源性高达98%,其中有118个碱基发生突变,插入37个碱基,14个位点发生碱基缺失;与鸡、鸭、鹌鹑、鸵鸟、红树林蛇的同源性分别为88%、83%、87%、86%和84%.[结论]GH基因编码序列具有较高的保守性. 相似文献