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[目的]为完善我国转基因检测方法体系,建立转基因大豆MON87751品系特异性实时荧光聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction, PCR)检测方法。[方法]根据MON87751的3′端邻接区序列设计特异性引物和探针,建立MON87751品系特异性实时荧光PCR检测方法,并测定该方法的灵敏度、特异性及可重复性。[结果]灵敏度测试显示,其定量下限为40拷贝;重复性试验显示其相对标准偏差在可接受范围内。[结论]该研究建立的MON87751品系特异性实时荧光PCR检测方法特异性良好,灵敏度高,有良好的可重复性,适合对转基因大豆MON87751品系进行检测鉴定。 相似文献
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《浙江农业学报》2017,(11)
转基因玉米MIR604是瑞士先正达公司2005年研发的抗虫玉米,中国于2008年批准MIR604进口作为食品和饲料的加工原料。为了精确定量检测MIR604及其加工产品,在MIR604的左侧边界序列和玉米基因组之间设计引物和探针,成功建立了MIR604品系特异实时荧光定量PCR检测方法。采用该方法设计的引物和探针,对6种非转基因作物、MIR604及其他非目标转基因作物进行检测,除MIR604外,其余样品均未检测到MIR604分子片段的扩增信号;对已知含量为1%的MIR604标准品进行定量检测,测量值为1.07%,接近真实值1%;灵敏度实验结果显示,该方法能检测到仅5个拷贝的MIR604分子片段。该试验所建立的MIR604品系特异实时荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性、准确度及灵敏度,可用于转基因玉米MIR604的定量检测。 相似文献
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对构建的适于转基因油菜RT73品系特异性检测标准分子pEASY-RT73在普通PCR和实时荧光PCR检测中的适用性进行了实验室间协同实验验证。对8家实验室结果的统计分析表明,标准分子pEASY-RT73对转基因油菜RT73品系特异性检测及油菜内源基因HMG和PEP检测具有高特异性。在普通PCR扩增中,标准分子对PEP和RT73品系特异性序列的检测下限均为20拷贝,对HMG基因的检测下限为50拷贝;在实时荧光PCR扩增中,HMG和RT73品系特异性序列的检测下限均为10拷贝,PEP检测下限为50拷贝。虽然各实验室所用仪器和试剂有较大差异,但对检测结果影响不大。因此,标准分子pEASY-RT73可稳定的作为新型标准物质用于转基因油菜RT73品系特异性普通PCR和实时荧光PCR检测。 相似文献
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[目的]运用微滴式数字PCR技术检测转基因玉米品系。[方法]基于微滴式数字PCR平台,建立3种转基因玉米品系TC1507、MIR162、MIR604的二重微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法。[结果]特异性试验结果显示,该法只有特定品系的靶序列才有扩增信号。灵敏度试验表明,该方法在10 pg基因组DNA用量时可定量检测到2~16个拷贝。[结论]该研究建立的3种转基因玉米品系定量检测方法特异性强、灵敏度高,可用于进出口农产品中3种转基因玉米品系成分的定量检测。 相似文献
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实时荧光定量PCR法测定禽蛋中沙门氏菌 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立禽蛋中沙门氏菌的荧光PCR法检测方法,根据invA基因序列设计实时荧光定量PCR引物和探针,常规方法提取菌体DNA,以55℃为退火温度进行荧光PCR扩增,并进行方法学考察。结果表明:阳性对照品和沙门氏菌为模板的样品有明显扩增曲线,其他菌株为模板的样品无扩增曲线,特异性、灵敏度和重现性考察提示实时荧光定量PCR方法符合检测方法学要求。实时荧光定量PCR法的应用,提高了禽蛋制品中沙门氏菌检测的灵敏度、缩短了检测时间、简化了检测流程。 相似文献
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TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪脂蛋白酯酶mRNA方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】克隆猪cDNA,作为猪LPL mRNA定量检测的标准品,建立检测方法。【方法】用RT-PCR,从猪背最长肌的总RNA中逆转录扩增LPL的cDNA,将纯化的LPL cDNA与pGM-T载体进行连接,转化宿主菌TOP10,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析,对质粒标准进行实时荧光定量PCR 检测。纯化质粒并检测260 nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。【结果】建立了猪LPL mRNA实时定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达103拷贝,线性范围为1×103 ～1×1010拷贝,阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（R2＝0.9871）。【结论】成功克隆了LPL实时荧光PCR定量标准,且TaqMan荧光定量RT-PCR的方法可对猪背最长肌LPL mRNA的表达进行准确定量。 相似文献
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根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR!Green I实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR Green I实时PCR方法。同时针对油菜FatA基因设计出内源基因。结果表明：应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2（±0.5）。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法。 相似文献
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根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR!Green I实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR Green I实时PCR方法。同时针对油菜FatA基因设计出内源基因。结果表明:应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2(±0.5)。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法。 相似文献
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根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR(R)Green Ⅰ实时PCR方法.同时针对油菜FatA基因设计出内源基因.结果表明:应用实时PCR技术,利用SYBR(R)Green Ⅰ染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2(±0.5).SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法. 相似文献
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为实现转基因耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’转化体成分的精准定量检测,以转基因大豆‘ZH 10-6’的5′端边界序列为靶序列,设计PCR扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针浓度进行优化,经特异性测试,建立了耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’的微滴式数字PCR检测方法。结果表明:1)特异性良好:只有以转基因耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’基因组为模板才有扩增信号;2)灵敏度高:在相对标准偏差≤25%的情况下,方法的检出限(LOD)为13.0个拷贝;定量限(LOQ)为66.0个拷贝;3)PCR扩增反应模板含量与样品拷贝数之间线性相关系数R2>0.99,DNA含量线性范围为0.08%~100.00%。综上,本研究建立的转基因耐除草剂大豆‘ZH 10-6’转化体定量方法特异性强、稳定性好、准确度和灵敏度高,可用于对转基因大豆品种‘ZH 10-6’的定量检测。 相似文献
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加工食品中通常含有多种作物成分,且其DNA遭到严重破坏,因而给转基因植物及其产品的PCR检测带来困难。采用植物中普遍存在的多拷贝叶绿体trn基因作为植物内源参照基因,用于转基因植物及其产品检测,研究结果表明,仅通过1次PCR反应即可确定加工食品中不同植物来源成分的种类,根据扩增片段及其大小,可区分水稻、玉米、油菜、大豆、棉花等不同作物成分。利用植物叶绿体DNA通用引物对植物来源DNA的检测灵敏度达0.01%,比用植物种间特异性单拷贝或低拷贝基因组DNA作为内源参照基因的检测灵敏度提高约10倍。 相似文献
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用PCR技术从一临床病猪组织中扩增出猪圆环病毒2型（PCV2）417 bp片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含有PCV2基因片段的重组质粒。应用该重组质粒进行实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的实时PCR标准曲线及其直线回归方程。结果显示该方法重复性好,其检测灵敏度达到102拷贝/μL,检测样品时特异性强。此研究表明,所建立的PCV2 DNA实时定量PCR方法具有重复性好、敏感性高与特异性强等特点,能够用于PCV2的定量检测。 相似文献
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目的:筛选一套灵敏度高、特异性强的引物探针,用于建立检测HBV病毒载量的荧光定量PCR方法.方法:通过PCR方法扩增HBV基因组片段,与T载体连接,制备工作标准品,并运用设计的荧光定量PCR对HBV DNA国家标准品进行检测.结果:以pMD18-T-HBc作为标准品,HBcF和HBcR为上下游引物,HBcP为探针所建立的荧光定量PCR检测HBV病毒载量方法的线性范围为109copies/mL到103copies/mL,批内重复性变异系数为0.20％一1.44％,批间重复性变异系数为3.08％～5.63％,检测国家阴阳性标准品的特异性灵敏度为100％,国家线性标准品的检测值与理论值的线性相关系数R为0.998.结论:成功筛选出一套荧光定量PCR检测HBV DNA的引物探针,并已建立了一种特异性灵敏性均非常高的荧光定量PCR检测HBV DNA的方法. 相似文献
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《福建农业学报》2020,(6)
【目的】转cry1Aa基因棉花南农6号为我国未经批准商业化种植的棉花品种。为监测其非法种植,解决阳性标准品不容易获得的问题,构建适合转cry1Aa基因棉花南农6号品系特异性检测的质粒分子pMD-NN6,以该质粒分子作为标准物质,建立相应的实时荧光定量PCR方法。【方法】根据南农6号转化体特异序列和棉花内标准基因acp1设计引物,采用重叠PCR方法构建质粒分子;以质粒分子作为标准物质,南农6号转化体特异序列为靶标,建立了南农6号棉花特异性定量检测方法。【结果】构建的质粒全长为3 148 bp,含有南农6号品系特异性序列和棉花acp1基因序列两个靶标片段的质粒分子,定量标准曲线斜率和扩增效率均符合要求,定量检测限为30拷贝。两个已知南农6号含量的混合样品(2.0%和0.5%)定量检测的准确度标准偏差均在±25%范围内,精确度相对标准差均≤25%。【结论】建立的PCR定量检测方法可以用于含有南农6号转基因棉花产品的品系特异性定量检测,所构建的标准质粒pMD-NN6可以代替其基因组DNA作为标准物质使用。 相似文献
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[目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法.[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针.然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线.[结果j抗虫基因拷贝数与Ct值的关系为Ct=-3.549 632X 43.783 512,相关系数R2为0.997 867.[结论]实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法具有特异性好、灵敏度高的特点. 相似文献
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《西南农业学报》2020,(6)
【目的】基于TaqMan-MGB探针建立虾肝肠胞虫(EHP)荧光定量PCR检测方法,为EHP的快速定量检测及实时监测提供技术手段。【方法】以EHP的SSU rDNA基因为检测靶基因,在其保守区设计特异性的扩增引物和TaqMan-MGB探针,将PCR扩增目标片段克隆至pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-T-SSU~(EHP)(标准品),以标准品DNA为模板优化反应体系,建立检测EHP的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR;以10倍梯度稀释的标准品DNA为模板构建扩增标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】制备的重组质粒pMD18-T-SSU~(EHP )DNA稳定性好,可满足作为标准品和阳性对照的要求;标准品(pMD18-T-SSU~(EHP))起始模板范围为2.0×10~1～2.0×10~9拷贝/反应时,建立的标准曲线线性关系良好,对应的线性回归方程为y=-3.232×lg(x)+39.51。基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR对标准品的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对临床虾样品EHP的检测灵敏度约10拷贝/mg,较农业农村部推荐的套式PCR约提高10倍;对虾类其他常见病原均无扩增反应,其组内和组间变异系数分别为0.26%～0.72%和0.56%～0.92%,整个检测过程可在1 h内完成。采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与套式PCR同时对276份临床虾样品进行检测比较,发现两种方法的符合率为96.7%,检测低拷贝数虾样品时前者具有更高的灵敏度;2018和2019年广西虾样品的EHP阳性检出率分别为16.2%和30.6%。【结论】基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品的EHP定量检测,可为EHP实时监测及EHPD快速诊断提供一种新的技术手段。 相似文献