共查询到16条相似文献，搜索用时 300 毫秒
1.
猪圆环病毒2型ORF2／猪白介素2（POIL-2）嵌合基因真核表达载体的构建、表达及在小鼠体内的免疫效果 总被引：2，自引：2，他引：0
为了研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus typc 2,PCV2)核酸疫苗,采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过--基因柔性接头(linker)(G4S)3,将PCV2的ORF2全长基因和猪白介素2成熟肽基因(PoIL-2)构建成PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因并克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中;筛选阳性重组表达质粒(rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2)转染COS-7细胞,分别采用PCV2抗原间接免疫荧光和PoIL-2蛋白ELISA方法检测COS-7细胞中表达的重组融合蛋(rCap-linker-PoIL-2)生物学活性;提取rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2和只含PCV2 ORF2基因的重组表达质粒PcDNA3.1/OFR2(rpcDNA3.1/OFR2)免疫Balb/c小鼠并检测其免疫效果.结果表明,成功构建了PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因及其pcDNA3.1( )重组表达质粒;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2在COS-7细胞浆内进行了表达,表达的rCap-linker-PoIL-2融合蛋白可分别与抗PCV2和抗PoIL-2蛋白抗血清发生特异性免疫反应,表明rCap-linker-PoIL-2蛋白具有Cap和PoIL-2蛋白的双重生物学活性;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒免疫小鼠后可诱导产生明显的抗PCV2抗体,且其诱导的抗体水平明显高于rpcDNA3.1/OFR2. 相似文献
2.
根据GenBank中猪2型圆环病毒的核苷酸序列,设计两对引物,对来源于河南省不同地市的4株PCV2细胞培养物进行鉴定,并扩增出ORF2基因,克隆到pMD18－T载体上,获得重组质粒pMD18-T-ORF2,并对其进行测序,结果表明所克隆的ORF2基因与其它PCV2 ORF2基因核苷酸同源性在92.4%～99.6%之间,氨基酸同源性在90.6％～97.9％之间。同时采用PCR从重组质粒pMD18-T-ORF2中扩增出587bp的ORF2基因,克隆到表达载体pET-32a,成功构建了重组质粒pET-32a-ORF2,经诱导表达了ORF2基因编码的结构蛋白,表达的重组蛋白为融合蛋白,分子量为40kD,经Western-Blot检测,重组蛋白可被PCV2阳性血清识别。 相似文献
3.
猪圆环病毒2型BF株ORF2基因在大肠杆菌中的表达 总被引：6，自引：0，他引：6
采用PCR从构建的猪圆环病毒2型／(PCV2)ORF2重组质粒(pGEM-T-ORF2）中扩增出大小为593bp的ORb2基因，克隆到表达载体pET-32a，经异丙基硫代半乳糖苷诱导，成功表达了ORF2基因编码的结构蛋白。表达的重组蛋白为融合蛋白，分子量40kD，表达量20％左右。经Western blot检测，重组蛋白可被PCV2阳性血清识别。 相似文献
4.
根据GenBank中猪圆环病毒2型(Porcine circovirus2,PCV2)的核苷酸序列设计2对引物,使用扩增全基因的引物对来源于河南省焦作、开封和滑县的3株PCV 2型JZ株、KF株和HX株的ORF2基因进行扩增,扩增片段克隆到pMD18 T上,获得重组质粒pMD18-T-ORF2,并对其进行测序,测序结果登录在GenBank上,登录号分别为EF028202、EF064149和EF467928.序列分析表明,PCV2河南分离株ORF2基因与其它PCV2 ORF2基因核苷酸序列同源性为92.4%～99.6%,氨基酸序列同源性为90.6%～97.9%,进化分析表明,河南分离株处于同一分支,与欧洲株亲缘关系较近.应用另一对引物从重组质粒pMD18-T-ORF2中PCR扩增出587 bp不包含核定位信号序列的ORF2基因,克隆到表达载体pET-32a,成功构建了重组质粒pET-32a-ORF2,经IPTG诱导表达了ORF2基因编码的结构蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting检测,表达的重组蛋白分子量约为40 kD,可被PCV2阳性血清识别,说明PCV2 ORF2基因得到成功表达. 相似文献
5.
根据猪圆环病毒2型（PCV2）LC株序列,设计合成3对引物,通过PCR扩增PCV2的3个不同ORF2基因片段,分别将其克隆到pET-32a载体中,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,表达并纯化了重组蛋白。Western-blot分析表明,重组蛋白可以与PCV2阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性。以纯化的重组蛋白初步建立了间接酶联免疫吸附实验（ELISA）方法,经方阵滴定确定最佳包被浓度为0．24μg／mL,血清最佳的稀释度为1：40。 相似文献
6.
猪细小病毒VLPs供外源蛋白插入的候选位点发现及其重组PCV2-ORF2的病毒样颗粒构建 总被引：2，自引：0，他引：2
先将猪细小病毒(PPV)SC-1株VP2基因扩增产物克隆到pMD18-T载体构建质粒pMD-VP2;设计两对引物(分别引入Hind Ⅲ和Sac Ⅰ两个酶切位点)扩增猪圆环病毒二型(PCV2)SC株ORF2基因,构建了pMD-ORF2.A和pMD-ORF2.B两质粒;经相应内切酶酶切后回收目的片段,插入PPV SC-1株VP2基因的Hind Ⅲ和Sac Ⅰ两个特异限制酶切位点处(分别对应于PPV VP2蛋白N端和C端1/3处),得到重组质粒pPVP2-ORF2.A和pPVP2-ORF2.B.经鉴定后的质粒pPVP2-ORF2.A和pPVP2-ORF2.B用Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ和ApaL Ⅰ三酶切,回收含VP2和ORF2基因的目的片段克隆至真核表达载体(pEGFP-C1),得到重组质粒pEGFP.VO.A和pEGFP.VO.B.脂质体法转染重组质粒于Cos7细胞后,采用荧光显微镜和电镜观察基因表达情况,结果仅在转染pEGFP.VO.A的样品中观察到了病毒样颗粒(VLPs).纯化VLPs免疫小鼠,结果显不能产生较好的细胞免疫和针对PPV和PCV2的特异性体液免疫,该结果表明研究中获得了PCV VP1-PCV2ORF2重组VLPs,同时也揭示PPV VPLs的N端1/3适于外源蛋白插入构建重组VLPs 相似文献
7.
真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的构建与表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为了构建由双CMV启动子调控的真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB,首先在pcDNA3.1(+)的基础上,构建出pcDNA3.1A和pcDNA3.1B,通过PCR扩增pcDNA3.1A上含-PCMV-MCS-BGHpolyA-表达单元的片段,定向克隆入pcDNA3.1B,即得载体pcDNA3.1AB。将DsRed与EGFP基因插入pcDNA3.1AB,分别构建pcDNA-DsRed、pcDNA-EGFP和pcDNA-DsRed-EGFP。质粒转染COS-7细胞瞬时表达,用荧光显微镜进行检测。结果双价质粒pcDNA-DsRed-EGFP能同时表达红色和绿色荧光蛋白基因,两基因表达强度无显著差异,且双价与单价质粒相比荧光蛋白表达强度相当。双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的成功构建和表达,为进行基因表达及双价核酸疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
8.
猪圆环病毒（Porcine circovims，PCV）属于环状病毒属，该病毒无囊膜，基因组为单链环状DNA，大小约为1．7kb，编码2个主要的开放阅读框架：ORF1和ORF2，ORF2编码病毒的核衣壳蛋白（Nawagitgul et al，2000），可能在PCV2病毒致病方面具有重要的作用。PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）．给养猪业带来了巨大的经济损失。分别用ORF2基因的亚单位疫苗免疫猪、核酸疫苗免疫小白鼠，均具有良好的效果（Blanchard et al，2003；Kamstrup et al，2004）。关于PCV2疫苗的研究在我国尚未处报道。本实验在异源启动子CMV下实现了ORF2在真核细胞中的表达。 相似文献
9.
将猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)orf2和猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)基因插入同一哺乳动物细胞表达载体pIRESneo中，构建出重组共表达质粒pIRES-orf2/gm-csf。以脂质体转染方法将重组质粒pIRES-orf2/gm-csf转染COS7细胞，经间接免疫荧光实验和集落刺激形成实验检测，结果表明orf2和gm-csf基因在COS7细胞中得到表达，转染细胞呈现特异性荧光，转染细胞培养上清能剌激猪骨髓细胞形成集落。重组质粒pIRES-orf2/gm-csf的成功构建为进一步研究猪圆环病毒2型的DNA疫苗奠定了基础。 相似文献
10.
根据GenBank上猪TNNC2（Fast skeletal muscle troponin C2）基因序列（GenBank accession No. DQ629177）设计一对引物,采用RT-PCR方法克隆得到617 bp TNNC2 cDNA片段（GenBank accession No. EF673726）,包括完整的开放阅读框（ORF）,与GenBank上公布的猪TNNC2基因（GenBank accession No. AY575058）的ORF核苷酸序列同源性达99 %,并发现开放阅读框内的5个点突变,319位点T→C,320 位点G→A,321位点C→T,导致氨基酸107位Ala（丙氨酸）→Met（蛋氨酸）,322位点A→G为同义突变,433位点A→T,导致氨基酸144位Glu（谷氨酸）→Asp（天冬氨酸）。根据已获得的TNNC2基因开放阅读框序列,重新设计引物扩增得到包含BamH I和EcoR I酶切位点的完整阅读框,将其首先克隆到pMD18-T载体中,经菌液PCR筛选和酶切鉴定后,用BamH I和EcoR I将目的片段切下,再克隆到原核表达载体pRSET A中构建重组表达质粒pRSET A-TNNC2。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG不同诱导条件诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot分析证实重组表达质粒pRSET A-TNNC2表达出24 kD左右的融合蛋白,最佳诱导时间为4 h,最佳的IPTG诱导浓度为0.6 mmol/L,表达产物以可溶性蛋白的形式存在。 相似文献
11.
采用酵母偏爱密码子合成五条编码猪IGF-I基因的引物，利用重叠PCR技术拼接获得长度为210bp的猪IGF-I成熟蛋白基因。将该基因插入分泌表达载体pPIC9K中，转化巴斯德毕赤酵母菌。经表型鉴定、PCR分析及G418筛选得到Muts型多拷贝整合菌，以1.5%甲醇诱导培养后，经SDS-PAGE检测表达产物，在7.5 kDa处出现一特异蛋白条带，目的蛋白表达量达410mg/L。Dot blot检测表明，重组蛋白可与抗IGF-I多克隆抗体反应。 相似文献
12.
为了研究禽流感病毒核蛋白（nucleoprotein,NP）在鸡体内所引起的免疫反应,将其NP基因从重组质粒pVAX-NP上酶切后亚克隆至含禽源启动子的真核表达载体pCAGGS中,经筛选鉴定后获得重组子pCAGGS-NP,将鉴定正确的阳性重组子体外转染真核细胞,利用间接免疫荧光法检测目的基因的瞬时表达;采用腿部肌肉注射途径将重组子免疫SPF鸡,利用ELISA检测免疫后血清抗NP蛋白抗体效价。结果表明,该重组子无论在体外还是体内均能正确表达禽流感NP蛋白,且所表达的蛋白均具有良好的免疫原性。 相似文献
13.
从猪真核表达质粒pGM-CSF通过PCR扩增出猪GM-CSF基因的编码序列,将GM-CSF基因亚克隆到生长抑素真核表达质粒pcS/2SS中,构建GM-CSF与生长抑素(SS)的融合表达质粒pGM-CSF/SS,酶切鉴定和DNA测序证实重组的融合表达质粒pGM-CSF/SS构建正确。选择30只小鼠,随机分为三组,其中1组为对照组,2组和3组分别肌肉注射pcS/2SS和pGM-CSF/SS,研究pGM-CSF/SS对小鼠的免疫效果。结果表明：GM-CSF可增强小鼠脾脏淋巴细胞的增殖能力,以pGM-CSF/SS组增殖能力最强,分别比对照组和pcS/2SS提高8.4%（P＜0.05）。肌肉注射pcS/2SS和pGM-CSF/SS免疫小鼠均能有效激发免疫系统,产生较强的免疫应答,与对照组相比,生长抑素抗体P/N值都有所提高,且随着免疫时间的延长,呈现不断增高的趋势;pGM-CSF/SS组P/N在试验的各个时期均高于pcS/2SS组。阳性鼠的比例以肌注pGM-CSF/SS为最高,达60%,pcS/2SS肌注组为30%,对照组没有出现阳性鼠;这些结果证明,GM-CSF对生长抑素DNA疫苗有一定的免疫增强作用,为研究GM-CSF基因对生长抑素DNA疫苗的免疫增强作用提供了理论基础。 相似文献
14.
用一段45个核苷酸的片段连接抗对硫磷抗体重链和轻链可变区基因片段VH和VL,获得了抗对硫磷单链抗体(single chain variable fragment,scFv)基因,构建了抗对硫磷scFv基因原核表达载体。SDS-PAGE和Western blot分析显示,该单链抗体基因能在大肠杆菌Origami 2中特异性表达,融合蛋白分子量约为28kD。用Ni-NTA金属亲和层析法对可溶性表达产物进行纯化,得到目的蛋白纯度为74.8%;ELISA反应结果证明,该单链抗体可以与对硫磷发生特异性反应。 相似文献
15.
猪瘟DNA疫苗的临床免疫实验 总被引：1，自引：0，他引：1
在前期研究工作筛选出2种DNA疫苗质粒的基础上,采用3种免疫策略(DNA疫苗单独免疫法、DNA疫苗初免蛋白免疫加强的prime-boost方法以及沙门氏菌(Salmonella)载体介导法),于某规模化猪场对猪瘟病毒(CSFV)的DNA免疫效果进行了临床应用研究。随机选择未经猪瘟疫苗免疫的断奶仔猪60头,分6组进行免疫接种,检测免疫猪抗体产生情况并对各组免疫猪进行攻毒试验。免疫猪血清抗体ELISA检测结果表明,pcDSW组、pIRE2IL2组、pcDSW E2protein组和pIRE2IL2 E2protein组均产生了较高的抗体水平,而沙门氏菌介导的2种DNA疫苗质粒诱导的抗体水平不显著。攻毒试验结果表明,pcDSW和pIRE2IL2单独免疫组或prime-boost组能够抵抗致死剂量的CSFV石门强毒攻击,保护率87.50%￣90.00%。其中pcDSW效果好于pIRE2IL2。而沙门氏菌介导的DNA疫苗组不能产生有效保护。不同接种途径的免疫效果比较结果表明,颈部肌肉注射免疫后产生的抗体水平较后肢胫前肌注射免疫产生的抗体水平高。 相似文献
16.
猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF)基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
通过RT-PCR方法,从经ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF）编码区的cDNA并将其克隆至pMD-19T载体,序列测定表明pGM-CSF基因的长度为435 bp,编码144个氨基酸。通过PCR方法获得缺失其N端17个氨基酸残基信号肽序列的成熟pGM-CSF蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达质粒pET-GM并转入大肠杆菌(Escherichia coli )BL21（DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白分子量约31 kD,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30.4% 。采用Ni2+-NTA亲和层析柱对经稀释复性的重组蛋白进行纯化,并采用MTT法以TF-1细胞检测纯化产物的生物学活性。结果表明,重组蛋白可有效刺激TF-1细胞增殖,其活性达到3.43×105 IU/mg。 相似文献