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1.
《南京农业大学学报》2014,(6)
为研究低氧诱导因子1α(HIF1α)及其下游基因胰岛素样生长因子2(IGF-2)和血管内皮生长因子(VEGF)在注射孕马血清促性腺激素(PMSG)(促排组)的促排卵巢与注射生理盐水(对照组)的普通卵巢组织中的mRNA转录水平,构建小鼠HIF1α基因真核表达载体,观察其转染的小鼠颗粒细胞中HIF1α基因的表达情况,以探讨HIF1α与小鼠卵泡发育的关系。用荧光定量PCR检测不同处理组织中HIF1α、VEGF及IGF-2 mRNA转录水平,免疫组化技术定位HIF1α在卵泡中的表达,基因重组技术构建HIF1α-pcDNA3.1真核表达载体并将其转染小鼠颗粒细胞,荧光定量PCR与Western blot技术检测转染细胞中HIF1α表达情况。结果表明:HIF1α在促排小鼠卵巢中的mRNA转录水平极显著高于普通小鼠卵巢组织(P0.01),在促排组和对照组的其他组织内HIF1αmRNA转录水平并无显著差异;HIF1下游基因VEGF和IGF-2在促排小鼠卵巢组织中的转录水平分别显著(P0.05)与极显著(P0.01)高于普通小鼠卵巢组织中的转录水平;卵泡发育至有腔卵泡后,HIF1α才开始在卵泡中表达;HIF1α-pcDNA3.1真核表达载体能够在颗粒细胞中转录HIF1αmRNA并翻译成蛋白。结论:HIF1α只在有腔卵泡内表达,其转录水平与卵巢内有腔卵泡数量成正相关,HIF1α通过上调VEGF和IGF-2参与卵泡的发育及成熟。 相似文献
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3.
猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。 相似文献
4.
为了构建含有EGFP的猪ProTα基因的真核表达载体,用RT-PCR从猪肾脏中扩增ProTα基因,连接到T载体,测序鉴定后,连接到pEGFP-N3真核表达载体,构建真核表达载体pEGFP-ProTα。通过脂质体法转染Vero细胞,进行荧光检测。结果表明,构建的pEGFP-ProTα真核表达质粒,转染Vero细胞后,经荧光观察EGFP-ProTα融合蛋白有向细胞核聚集的现象。结论:本研究成功构建了真核表达载体pEGFP-ProTα,并在Vero细胞中表达,为研究猪ProTα的功能奠定了基础。 相似文献
5.
《西南农业学报》2015,(5)
构建β半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I(ST3GALI)基因的真核表达载体p IRES-ST3GALI,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达。以p GEM-ST3GALI质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增ST3GAL I基因,通过酶切和连接,构建真核表达载体p IRESST3GALI。经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,转化筛选阳性重组大肠杆菌(DH5α),用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,并用12%SDS-PAGE鉴定。结果表明,重组质粒p IRES-ST3GAL I中的ST3GAL I序列与原鸡的ST3GAL I氨基酸序列同源性98.8%,与猪的同源性达53.5%,与人的同源性达52.6%。β半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I在大肠杆菌中实现了良好的表达。本试验已成功构建了含有β半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I(ST3GAL I)的真核表达载体p IRES-ST3GAL I,为其转染传代细胞建立重组传代细胞系奠定了基础。 相似文献
6.
鹅属于卵生动物,在适宜环境的条件下,卵巢上的卵泡可持续发育、成熟、排卵,发育到性成熟的时候受精。ERK信号通路中myc和srf基因在鹅等级前卵泡发育中起着一定的作用。以籽鹅为试验动物,围绕鹅等级前卵泡发育调控机制展开研究。利用qRT-PCR方法检测在鹅等级前卵泡的ERK通路中myc和srf基因mRNA表达情况。结果表明:在籽鹅的各个等级卵泡中目的基因均有表达,且在不同等级卵泡中不同目的基因的表达情况不同。表明ERK信号通路相关基因可能在鹅的卵泡闭锁现象中发挥一定的作用。 相似文献
7.
《延边大学农学学报》2017,(3)
根据已知的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶基因ORF全长序列,分别设计1对带有粘性末端酶切位点EcoRI和NotI的特异性引物,PCR克隆得到桦褐孔菌内切葡聚糖酶(endo-l,4-β-D-glucanase,EG)和β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BGL)ORF基因全长,将酶切后的目的片段分别与真核表达载体pPICZαA连接,构建出真核表达载体pPICZαA-EG和pPICZαA-BGL,并成功转化到毕赤酵母GS115中,为下一步纤维素酶的表达和功能验证奠定了基础。 相似文献
8.
构建硬酯酰辅酶A去饱和酶1(Stearoyl-CoA Desaturase l,SCD1)真核表达质粒pcDNA3.1(+)/SCD1,转染鹅原代肝细胞验证其对细胞中脂肪代谢的影响。根据鹅SCD1基因设计带有酶切位点引物,RT-PCR扩增SCD1基因,克隆至pMD-19T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,构建重组真核表达载体pCDNA3.1(+)/SCD1。酶切及序列测定测序正确后转染鹅原代培养肝细胞,荧光定量PCR检测SCD1基因的表达,并用油红O染色检测细胞中脂滴情况。结果:成功构建SCD1基因真核表达载体,转染鹅原代培养肝细胞后SCD1基因获得了表达,与脂肪代谢相关基因SREBP表达上调,同时检测到细胞中脂滴明显增多。结论:构建了重组质粒pCDNA3.1(+)/SCD1,并在鹅原代培养细胞中获得表达,为进一步研究SCD1基因在鹅肝脏脂肪代谢中的作用奠定基础。 相似文献
9.
【目的】构建I型胶原蛋白α1链基因（COL1A1）过表达载体,并分析其对颗粒细胞中胶原蛋白家族基因和产羔相关基因的影响,为后续深入研究COL1A1基因影响山羊产羔性状的分子机制打下基础。【方法】通过重叠延伸PCR克隆COL1A1基因A和B片段,然后分别重组连接至pUC57和pcDNA3.1（+）线性化载体上,再通过酶切连接获得COL1A1基因全长,构建pcDNA3.1(+)-COL1A1过表达载体;转染山羊卵巢颗粒细胞后,通过Western blotting检测COL1A1蛋白表达效率,采用免疫荧光检测其在颗粒细胞中的定位情况,并以实时荧光定量PCR检测COL1A1基因过表达对胶原蛋白家族基因COL1A1、COL2A1和COL3A1及产羔相关基因[骨形态发生蛋白15(BMP15)、骨形态发生蛋白受体1B(BMPR1B)、生长分化因子9(GDF9)和促卵泡激素β亚基（FSHB）]表达的影响。【结果】COL1A1基因全长环化质粒检测大小为1847 bp,连接至pcDNA3.1（+）线性化载体上成功构建获得COL1A1基因过表达载体。Western blotting检测结果表明,pcDNA3... 相似文献
10.
《江苏农业学报》2016,(3)
为了解苏淮猪BMP4基因的序列特征和表达特征,本研究采用克隆测序技术获得苏淮猪BMP4基因编码区全序列,利用生物信息学方法分析BMP4基因的序列特征,采用RT-PCR技术检测BMP4基因在苏淮猪不同组织中的表达情况,构建苏淮猪BMP4基因真核表达载体并利用Western blot技术检测BMP4真核表达载体的表达情况。结果显示苏淮猪BMP4基因编码区序列长度为1 230 bp,编码409个氨基酸,与其他哺乳动物氨基酸序列的一致性均在97%以上;苏淮猪BMP4编码蛋白含有典型的TGF-β前肽和TGF-β样结构域;BMP4基因在苏淮猪卵巢组织中高表达;成功构建苏淮猪BMP4基因真核表达质粒pc DNA3.1-BMP4,转染后可显著上调猪卵巢颗粒细胞BMP4蛋白表达水平。 相似文献
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小麦矮秆基因Rht3和赤霉酸不敏感基因Gai3与a—淀粉酶的表达 总被引：6，自引：0，他引：6
以小麦赤霉酸反应不敏感的Ｒｈｔ３矮秆基因两个近等基因系及其分离群体为材料,分析了Ｒｈｔ３、Ｇａｉ３与ａ－淀粉酶表达的相互关系。结果表明,Ｒｈｔ３、Ｇａｉ３能强烈地抑制萌发籽粒ａ－淀粉酶的表达,降低ａ－淀粉酶活性水平。高矮亲本间ａ－淀粉酶活性差异明显,矮扬３、矮苏３和扬麦３号、苏麦３号的ａ－淀粉酶ＯＤ值分别为０．０７１,０．０８０和０．０６３５,０．７２０。经Ｘ＾２测验,两群体中ａ－淀粉酶生高、中、 相似文献
12.
从120日龄的长白猪脑垂体组织中扩增出pGH基因的cDNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-pGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,并将其转染PK15细胞,通过荧光素酶活性检测特异性表达强度.结果表明,成功构建了pEGFP-N1-pGH真核表达载体,为转基因猪的研究奠定了基础。 相似文献
13.
[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。 相似文献
14.
【目的】 研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】 以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】 (1)薰衣草DXS基因开放阅读框长为2 181 bp,编码由726个氨基酸组成的蛋白质序列;薰衣草DXS蛋白等电点为6.57,分子量约为78.39 KDa,具有高度的保守性,与狭叶薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花的DXS蛋白亲缘关系相近;(2)DXS基因在杂花花器官的衰败期表达量最高,在法国蓝花器官的盛开期表达量最高,DXS基因在杂花花器官五个不同发育时期的表达量均高于法国蓝;DXS基因在杂花花萼中表达量最高,在法国蓝雄蕊中表达量最高,DXS基因在杂花花器官5个不同组织表达量均高于法国蓝(雌蕊、雄蕊除外);(3)在37℃、IPTG 0.8 mM条件下诱导4 h后,DXS蛋白表达量最大。【结论】 DXS基因表达量与薰衣草精油产量存在正相关关系。 相似文献
15.
人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体具有特异性诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性的特点,被认为是肿瘤凋亡疗法较有希望的候选药物。植物生物反应器在药用蛋白质生产方面具备较大优势。构建了可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的植物表达载体,进行本氏烟(Nicotiana benthamiana)瞬时表达,并对目的蛋白的体外活性进行检测。结果显示,本氏烟叶片中目的蛋白平均表达量为68.60 pg/mg TSP;在浓度为200 pg/m L时,对NCI-H460细胞株的抑制率为28.75%。研究表明,经密码子优化的编码基因能够在受体植物中表达出有活性的目的蛋白,为开展目的基因的稳定转化工作奠定了基础。 相似文献
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动物的性别在畜牧业是一项很重要的经济性状，而哺乳动物的性别决定受睾丸决定基因Sry的启动，获得SRY蛋白并探索它与其他相关因子之间的相互关系对于深入了解该因子的作用机理和寻求高效经济的性别控制方法尤为重要。本研究以小鼠为实验材料，通过PCR、质粒重组、酶切和测序等方法构建小鼠Sry的原核表达载体，使用IPTG诱导蛋白表达、SDS-PAGE电泳和western blotting等方法检测重组表达载体的原核表达。PCR、酶切和测序结果一致显示成功地构建了原核表达载体pET-21b-Sry；使用anti-Sry和anti-His特异性抗体进行的western blotting实验结果验证了蛋白表达的正确性。本实验不仅实现了哺乳动物性别决定因子的Sry原核表达，而其还获得了具有生物活性的SRY蛋白，对于深入研究Sry及其他相关基因的相互作用奠定了实验基础。 相似文献
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《山西农业科学》2017,(5)
为了构建鼠的CTCF与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的原核表达载体,并进行原核诱导表达及鉴定,以pMXs-3Flag-m CTCF为模板,PCR扩增得到mCTCF序列,目的基因片段EcoRI,SalI双酶切后连接到同样双酶切的pMal-C2G载体上,测序鉴定。将测序正确的质粒转化到E.coli BL21中,用IPTG诱导融合蛋白的表达,用SDS-PAGE分离检测蛋白表达效果。经菌液PCR、测序鉴定、双酶切鉴定证明,得到的重组质粒pMal-C2G-mCTCF构建成功,且成功诱导出了MBP-mCTCF融合蛋白,最佳诱导条件为:10×10~(-4) mol/L IPTG浓度在37℃诱导6 h。 相似文献
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小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达，以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据GeneBank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物，以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板，经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接，转化TGⅠ大肠杆菌，筛选阳性克隆，其扩增片段测序结果与原序列一致，表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21（DE3）表达菌株中，经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定，并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达，主要以包涵体形式存在；融合蛋白的分子量为63 kD；以IPTG终浓度为0.8 mmol•L-1，诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达，为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。 相似文献
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The aim of this study is to construct a prokaryotic expression vector of mouse Nanog gene and to express it in E. coli. A pair of primers was designed according to digestion sites in plasmid pGEX-KG and the Nanog gene sequence published by GenBank. The DNA fragment of 918 bp was amplified by polymerase chain reaction （PCR） from the pNA992 recombinant plasmid with Nanog gene, then cloned into pGEX-KG and transformed into the host E. coli strain TG Ⅰ. The sequence of the fragment was matched with the original sequence of pNA992. It indicated that fusion expression vector, pGEX-KG- Nanog, was constructed successfully. The pGEX-KG-Nanog plasmid was extracted from E. coli strain TG Ⅰ and was transformed into BL21（DE3） for expression. After induction by isopropyl-β-D-thiogalactoside （IPTG） at 37℃, the expression product of Nanog gene was identified by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）, and the expression condition was optimized. Nanog fusion protein was successfully expressed in the form of inclusion bodies. The molecular weight of the inclusion body was 63 kDa. Meanwhile, the optimum condition for the expression of Nanog fusion protein was induced with 0.8 mmol L^-1 IPTG for 5 h. The mouse Nanog gene was successfully expressed in E. coli, which laid a foundation for the purification of Nanog protein and for the preparation of polyclonal antibody. 相似文献