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低毒病毒／板栗疫病菌系统是一个具有独特优点的、崭新的研究病毒与宿主相互作用的模型系统。以同源重组为基础的基因打靶是研究基因功能和病毒与宿主相互作用分子机制的重要手段。为了研究在板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小对同源重组频率的影响，利用一段5．4kb板栗疫病菌染色体DNA序列，构建了以潮霉素抗性基因为遗传转化筛选标记的3个同源双交换片段以及3个同源单交换质粒，分别转化板栗疫病菌EPl55原生质体，检测筛选同源重组转化子并计算发生同源重组频率。结果表明，在板栗疫病菌中3个同源双交换片段FHA1（1．7～2.0kb）、FHA2（1.0～1.2kb）和FHA3（0.5kb）的同源重组频率分别为3．73％、2。06％和0；3个同源单交换质粒pFHl（1．76kb）、pFH2（1．23kb）和pFH3（O．54kb）的同源重组频率分别为0.95％、0和0。这些结果为板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小的设计提供了依据。 相似文献
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低毒病毒/板栗疫病菌系统是一个具有独特优点的、崭新的研究病毒与宿主相互作用的模型系统.以同源重组为基础的基因打靶是研究基因功能和病毒与宿主相互作用分子机制的重要手段.为了研究在板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小对同源重组频率的影响,利用一段5.4 kb板栗疫病菌染色体DNA序列,构建了以潮霉素抗性基因为遗传转化筛选标记的3个同源双交换片段以及3个同源单交换质粒,分别转化板栗疫病菌EP155原生质体,检测筛选同源重组转化子并计算发生同源重组频率.结果表明,在板栗疫病菌中3个同源双交换片段FHA1 (1.7～2.0 kb)、FHA2 (1.0～1.2 kb)和FHA3 (0.5 kb)的同源重组频率分别为3.73% 、2.06%和0;3个同源单交换质粒pFH1 (1.76 kb)、pFH2 (1.23 kb)和pFH3(0.54 kb)的同源重组频率分别为0.95% 、0和0.这些结果为板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小的设计提供了依据. 相似文献
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通过PCR扩增,从融安金柑基因组DNA中克隆出一条2 361 bp的DNA片段,该DNA克隆含有1个2 081 bp的LEAFY同源基因全长序列(FcLFY)。金柑LEAFY同源基因包含2个内含子和3个外显子,编码398个氨基酸。比对结果表明,金柑LEAFY同源基因与甜橙、枳的LEAFY同源基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为98%。该研究为今后从分子水平上研究金柑开花调控机理打下了坚实的基础。 相似文献
4.
龙眼成花逆转相关基因表达的cDNA-AFLP分析 总被引：5，自引：0，他引：5
摘要：以龙眼正常成花花芽和成花逆转花芽为试材,应用cDNA-AFLP技术,研究龙眼正常成花与成花逆转花芽cDNA的差异表达,并利用RT-PCR技术验证,探讨了龙眼成花逆转的分子机制。通过64对引物组合的cDNA-AFLP分析获得了2 560条扩增片段。选择其中有明显差异的片段进行回收、测序,获得了14条核苷酸序列。其中有13个片段在GenBank数据库中发现同源序列,1个功能未知。通过核酸和氨基酸比对分析,与龙眼成花逆转相关的112基因片段同源于银灰杨（Populus tremula x Populus alba）中编码Nek激酶家族(NIMA related protein kinases)基因（83 ％）, 331的核苷酸序列（80％）同源于与拟南芥（Arabidopsis thaliana）中编码内切-1,4-β-葡聚糖酶(EGases)的基因,313的核苷酸序列（78%）同源于与柑橘（Citrus sinensis）中的几丁质酶（chitinase CHI1）基因。 相似文献
5.
玉米耐旱自交系在干旱条件下的mRNA差异表达 总被引：3，自引：3，他引：3
用16%PEG-6000对玉米耐旱自交系“81565”进行模拟干旱处理,用DD-PCR技术研究干旱与正常浇水对照的mRNA差异表达,发现3个干旱条件下差异表达的特异片段MD1、MD2和MD3。MD1和MD2在干旱条件下减量表达,MD3为干旱诱导表达。序列分析和同源性比对表明,MD1与玉米叶绿体基因组中编码参与RNA转录本Ⅱ型内含子剪切的成熟酶的matK基因有93%的相似性,MD2与极端耐旱的Sporobolus stapfianus的丝氨酸/苏氨酸2C型蛋白磷酸酶基因PP2C的相似性达99%,MD3与属天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶类的水稻metacaspase基因有99%的相似性。根据各自序列相似同源基因的功能推测,MD1、MD2和MD3三个片段可能与“81565”的耐旱机制有关。 相似文献
6.
本研究以阿蒂擎天(Cuzmania Attila)植株为材料,利用400μL/L 乙烯利灌心,处理0、1 h、6 h和24 h,分别提取总RNA,纯化获得mRNA,以处理0 h的材料为驱动,运用抑制差减杂交技术进行正向差减杂交,获得3个差异表达基因文库.随机挑取3个文库中的1063个白斑,利用菌落PCR方法,筛选到990个阳性克隆,全部进行了序列测定与分析,结果表明,其中有518个基因序列,205个片段与GenBank中已知基因高度同源,313个片段未发现同源基因.利用地高辛标记对部分序列进行反向Northern斑点杂交分析,发现乙烯处理1~6h,诱导表达的基因数量最多 相似文献
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Bt cry I A（c） 杀虫基因向棉内生细菌Bacillus cereus染色体中整合的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
将来自Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki的Bt CRy I A(c) 杀虫基因通过综合质粒载体pBC601，整合到棉花（Gossypium hirsutum)优势内生细菌Bacillus cereus(Bc9002)的染色体上，得到的工程菌对棉铃虫（Helicoverpa armigera Hb.)有杀虫活性。此综合质粒含有能在营养期表达Bt cry I A(c) 基因的强启动子，cry I A(c)杀虫基因，四环素抗性标记基因tet^r 8.0kb的EcoR I-Nco I B.cereus染色体片段。将综合质粒通过电击导入B.cereus(Bc9002)中，综合质粒因含B.cereus染色体片段，可与B.cereus染色体发生同源重组，从而将Bt cry I A(c)基因整合到B.cereus的染色体上。通过对转化子的DNA酶切分析，PCR扩增，SDS－PAGE凝胶电泳检测，ELISA检测，电镜观察，毒力测定。结果表明Bt cry I A(c)基因已经整合到内生细胞Bc9002的染色体上，并可高效表达。 相似文献
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鸡、猪BPI氨基端的基因克隆和鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了克隆杀菌/通透性增加蛋白(BP I)N端cDNA,构建重组体pM D 18-T-BP I,并进行序列鉴定,应用RT-PCR技术,参照G enB ank报道的预测序列,从鸡多形核白细胞(PM N)mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白(BP I)氨基端95个氨基酸的基因片段,并与pM D 18-T连接,构建BP I氨基端的基因重组体,进行酶切鉴定和序列测定;从猪PM N的总mRNA中扩增出BP I氨基端48个氨基酸的基因片段,进行测序鉴定。获得鸡BP I N端长度为285 bp的基因片段。序列分析证实该片段中有3个点突变,但均不在活性中心;获得猪BP IN端长度为146 bp的基因片段。成功克隆出BP I N端基因,经序列测定,确认为BP I基因,为进一步表达该基因奠定了基础。 相似文献
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番茄乙烯信号转导相关基因EIN3（Le-EIL）的克隆和表达 总被引：2，自引：0，他引：2
摘要：根据拟南芥?穴Arabidopsis thaliana ?雪、烟草?穴Nicotiana tabacum ?雪EIN3基因保守区序列设计简并引物，采用RT-PCR扩增从番茄(Lycopersicon esculentum )果实中得到一个486 bp的同源片段。以此片段作为探针，从番茄果实cDNA文库中分离到一个拟南芥EIN3的同源基因的cDNA克隆,命名为Le-EIL。该克隆含有一个1 845 bp的开放阅读框，编码615个氨基酸。经同源分析，它与烟草TEIL基因的同源性为79%，与拟南芥EIN3、EIL1、EIL2和EIL3的同源性分别为59%、56%、52%、46%。Le-EIL基因表达与番茄果实的成熟及乙烯生成情况具有较强的相关性。在普通番茄果实的不同成熟时期Le-EIL基因都有表达，并且随着成熟度的增加基因表达有明显的增强，在转色期和粉红期Le-EIL基因的表达最强, 在全红期后减弱。在转反义ACS基因的转基因番茄果实中，只有开花后60 d的果实中Le-EIL基因有微弱的表达，在其它成熟时期均没有表达。 相似文献
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摘要：利用PCR技术，扩增去除部分序列、长度为1320 bp、编码440个氨基酸的禽流感病毒(AIV)NP基因片段，将其克隆至pR质粒的T4噬菌体SOC基因C末端获得重组质粒pR-NP，以此重组载体转化大肠杆菌E2，用溶菌酶缺陷噬菌体T4-Z1感染重组E2菌，重组载体与缺陷噬菌体T4-Z1基因发生同源重组，将NP基因整合到噬菌体基因组中，用PCR方法筛选重组噬菌体并命名为T4-Z1-NP。经Western blot检测证实，T4-Z1-NP表达的NP融合蛋白具有免疫学活性。成功构建了表达禽流感病毒核蛋白的重组噬菌体。 相似文献
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ｎｆｅＣ基因是从慢生型大豆根瘤菌中克隆到的,与竞争结瘤有关的基因。本研究从慢生型大豆根瘤菌菌株ＧＸ２０１的ｐＬＡＦＲ３为载体的基因文库中,筛选出与ｎｆｅ同源基因克隆。以转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５诱变获得了ｇｕｓ基因表达的Ｔｎ５ｇｕｓＡ５插入突变质粒。 相似文献
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Barros-Velázquez J Jiménez A Villa TG 《Journal of agricultural and food chemistry》2002,50(22):6563-6568
The molecular identification of several strains of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli involved in foodborne disease was carried out by investigating the restriction profiles of their chromosomal DNA and by DNA/DNA hybridization. Cleavage with EcoRV allowed the visualization of a 3 kb DNA fragment characteristic of C. jejuni, whereas restriction with ClaI allowed the identification of a 9.3 kb DNA fragment, also characteristic of C. jejuni, and a DNA duplet of 9.5-10 kb, specific to C. coli.Restriction analysis with enzyme BglII allowed the visualization of DNA fragments of 3.5, 4, and 6.7 kb, characteristic of C. jejuni. C. jejuni subsp. doylei strains investigated shared a higher genetic homology among themselves-as determined by DNA/DNA hybridization-than with C. jejuni subsp. jejuni. A DNA probe, initially designed by Korolik et al. (Korolik, V.; Coloe, P. J.; Krishnapillai, V. J. Gen. Microbiol. 1988, 134, 521-529), including a DNA fragment encoding an antigenic membrane protein of 31.5 kDa in C. jejuni, when used as probe, allowed the specific identification of all strains of C. jejuni through the detection of strong hybridization signals in two BglII DNA fragments of 2.3 and 2.5 kb, which were not observed in C. coli. Cleavage of chromosomal DNA with BglII-either alone or coupled with probing assays with specific probes-proved to be a valuable tool for the speciation of Campylobacter isolates involved in foodborne disease. 相似文献
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以从野油菜黄单胞菌野油菜致病型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）胞外多糖突变体Ｔ１１３中克隆的含转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５及其两侧相邻序列的１２．３ｋｂＥｃｏＲＩＤＮＡ片段为探针,从野生型菌株８００４中克隆到与突变位点相对应的６．５ｋｂＥｃｏＲＩ片段,克隆于载体ｐＬＡＦＲ３上的该片段能反式互补突变株Ｔ１１３的胞外多糖产生,说明该片段上含有至少一个与胞外多糖产生有关的基因。 相似文献
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猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白5'端基因重组腺病毒的构建及其免疫特性 总被引：2，自引：0，他引：2
RT-PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）S蛋白基因5'端包含 B、C抗原位点的1.0 kb DNA片段,并与穿梭载体pShuttle-CMV连接;然后与腺病毒（Adenovirus）骨架载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌（Escherichia coli）BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒。该重组腺病毒质粒转染HEK293细胞并进行噬斑纯化,获得了1株含有TGEV S蛋白5'端基因的重组人复制缺陷型血清5型腺病毒rAd-TGEV-S。随后用RT-PCR和间接免疫荧光（indirect immunofluorescent assay, IFA）检测目的基因的转录与表达。重组腺病毒rAd-TGEV-S在HEK293细胞连续传代9次后,病毒效价稳定,滴度平均为107. 7TCID50/mL。动物免疫试验显示, rAd-TGEV-S可以诱导小鼠产生TGEV特异性IgG和IgA。 相似文献
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检测到水稻白叶枯病菌能产生一种“跨菌调控因子”，在固体平板上，这种因子由白叶枯病菌分泌到细胞外后可以扩散并进入甘蓝黑腐病菌，调控甘蓝黑腐病菌致病因子的表达．本研究从水稻白叶枯病菌中克隆鉴定了一个与这种“跨菌”调控因子合成有关的基因ｒｐｆＦ，通过转座子诱变和标记置换（ｍａｒｋｅｒｅｘｃｈａｎｇｅ）技术，构建了ｒＰｆＦ突变体，突变体丧失了产生这种“跨菌”调控因子的能力，在水稻植株上的致病能力明显减弱，ＤＮＡ序列分析得知ｒｐｆＦ基因编码的产物和大肠杆菌的３－酮脂酰－ＣＯＡ硫解酶（３－ｋｅｔｏａｃｙｌ－ＣＯＡｔｈｉｏｌａｓｅ）同源。 相似文献
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烟草扭脉病毒部分基因组特征及其分类地位分析 总被引：1，自引：0，他引：1
通过RT-PCR从烟草丛顶病发病烟株总RNA中获得烟草扭脉病毒（Tobacco vein distorting virus,TVDV）基因组部分序列。序列分析显示该片段全长1655bp,共包含TVDV的部分RdRp基因、完整的CP基因和完整的MP基因。其中RdRp基因与CP基因的间隔区（IR）长201nts,符合马铃薯卷叶病毒属病毒的归属依据;对RdRp、CP、MP基因以及IR序列的对比分析,显示了TVDV与黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属病毒的较高同源性。根据三个ORF编码的氨基酸序列构建的分子同源树的分析,也都显示了TVDV与黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属病毒的同源性最高,进一步证实了TVDV应该是黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属的确定成员。 相似文献
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应用LA-PCR的方法,从荷斯坦牛基因组中成功地扩增获得6.0 kb和1.78 kb两个基因片段,其中6.0 kb包括αs1-酪蛋白基因5′调控序列到第三内含子部分,1.78 kb包括αs1-酪蛋白基因第十二内含子到第十四内含子之间序列,作为打靶载体的同源臂;从新生儿血液基因组中扩增获得5.5 kb的血小板生成素（thrombopoietin,TPO）基因组序列,包括第一内含子部分序列到3′终止子后的序列。以水牛β-酪蛋白基因的5′调控区4.4 kb片段为启动子,以pLoxp质粒为打靶载体骨架,加上同源臂片段和目的基因TPO的片段,经多步酶切-连接-转化-筛选-鉴定基因重组过程,最终建成长达25 kb的人TPO基因定点整合荷斯坦牛αs1-酪蛋白基因打靶载体,PCR和酶切分析表明载体构建正确,为研制定点整合荷斯坦牛乳腺生物反应器奠定了基础。 相似文献
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大肠杆菌海藻糖磷酸合酶基因的克隆 总被引：1，自引：0，他引：1
根据报道的大肠杆菌（Escherichia coli)海藻糖－6－磷酸合酶基因（otsA)，设计引物，通过PCR技术从大肠杆菌XLI菌株的总DNA中扩增到一个1．4kb片段。经克隆、测序分析，该片段长1425bp并含一完整的开放读框（ORF）。在核苷酸水平上，该ORF与已报道的otsA基因具有99．86％的同源性。在氨基酸水平上，其推断性的编码产物蛋白与OtsA具有100％一致性。 相似文献