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为在体外获得奶牛溶菌酶(lysozyme,LYZ),人工设计并合成LYZ基因CDS序列,将其克隆至表达载体pET32T并转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性菌株,经IPTG诱导,初步纯化表达产物,并对其进行SDS-PAGE分析。结果表明,重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定结果正确,表达产物经SDS-PAGE检测,分子量约为33kd,与目标蛋白质一致,且主要以包涵体的形式存在。用比浊法测得的溶菌酶活力为2 139U/mL。研究结果成功构建原核表达载体LYZ-pET32T并表达得到奶牛溶菌酶蛋白,为后续研究与应用奠定了基础。 相似文献
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鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法从鸡外周血淋巴细胞中扩增鸡β-防御素-3成熟肽基因,将其克隆到酵母表达载体pPICZα-A的分泌信号肽基因下游.线性化后的重组质粒电击转化毕赤酵母宿主菌GS115,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后,得到重组酵母菌.阳性转化菌经甲醇诱导后,SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明,在毕赤酵母中得到分泌性表达产物,分子量约为8.9 ku,活性检测表明其具有显著的抑菌活性. 相似文献
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从人胎盘组织中克隆获得人溶菌酶基因hLYZ,选用体内表达载体pcDNA3.1,构建表达载体pcDNA3.1hLYZ,并转染至小鼠体内,采集小鼠乳汁和乳腺组织,通过RT-PCR方法检测基因的表达水平,用免疫组化反应、Western blotting检测蛋白的表达,并通过体外抗菌活性检测重组人溶菌酶的抗菌活性。经酶切鉴定和核苷酸序列测定,表明重组质粒pcDNA3.1-hLYZ构建正确,小鼠乳清的SDS-PAGE电泳显示在约14700处有特异的蛋白条带出现,Western blotting检测表明成功表达了人溶菌酶,根据回归方程计算酶活性为4011U/mL,体外抗菌活性检测结果显示重组人溶菌酶对大肠杆菌有明显裂解作用。本试验成功地在小鼠乳腺中表达了重组人溶菌酶,表达的蛋白具有较高的酶活性,这些结果为哺乳动物乳腺生物反应器的研究奠定了基础。 相似文献
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根据乳酸乳球菌密码子的偏嗜性,优化设计并合成牛乳铁蛋白肽的两段基因序列LFcinB和LFampin,将其与乳酸乳球菌表达载体pAMJ399分别用SalⅠ和BglⅡ双酶切后进行连接,并电转化至乳酸乳球菌MG1363中,经酶切鉴定表明获得带有两段牛乳铁蛋白肽基因的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFcinBA/MG1363。结果表明,优化表达条件,在GM17培养基中添加3.8%的β-甘油磷酸二钠可以获得表达重组蛋白的适宜pH,West-ern-blot检测可见重组蛋白大小约13 ku,表明牛乳铁蛋白肽在重组乳酸乳球菌中获得了表达。 相似文献
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本文旨在构建抗菌肽parasinⅠ大肠杆菌重组表达载体,表达人工重组parasinⅠ,并检测其抑菌活性。根据parasinⅠ的成熟肽序列和大肠杆菌密码子偏好性,人工合成1段57 bp的基因编码cDNA,通过PCR技术构建大肠杆菌重组表达质粒pET32-ParaⅠ,并在parasinⅠ基因5’-端引入Xa因子酶切位点。重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株后,在不同温度(37和20℃)条件下对阳性转化子进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果表明:IPTG成功诱导了1个21 ku的融合蛋白表达,重组蛋白占菌体总蛋白质的45%～50%。在低温条件下产生的融合蛋白主要以可溶性形式存在。可溶性重组蛋白经亲和层析纯化后,用Χa因子进行酶切,酶切产物经琼脂孔扩散法抑菌活性检测,结果显示其对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。本试验实现了parasinⅠ的重组表达,表达产物经Χa因子酶切后具抑菌活性。 相似文献
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为了研究卡那霉素抗性(KanR)基因能否在哺乳动物细胞中表达以及用含相同抗性基因重组质粒防治奶牛乳腺炎的安全性,用PCR从重组质粒p215C3LYZ中扩增得KanR基因,将其克隆入原核表达载体pQE-31,用含卡那霉素(Kan)琼脂平板筛选得KanR重组菌,经IPTG诱导成功表达了预期大小的Kan抗性融合蛋白;用纯化的重组蛋白免疫小鼠,获得了Kan抗性蛋白抗血清,经Western blotting证明免疫血清特异性良好;分别用重组质粒pQE-Kan和p215C3LYZ转染COS-1细胞,在不含抗生素培养液中培养后分别收集细胞上清和细胞裂解物;将转染细胞上清分为添加和不加Kan组,接种Kan敏感菌DH5α大肠杆菌,培养物的OD600检测结果显示,添加组的指示菌生长被抑制,转染细胞上清中无Kan抗性蛋白表达;以Kan抗性蛋白免疫血清进行的Western blotting结果显示,转染细胞内无Kan抗性蛋白表达;将p215C3LYZ注射奶牛乳腺,用脱脂和浓缩奶样进行Western blotting检测,结果显示试验牛乳中也无Kan抗性蛋白表达。这些试验结果提示,来源于原核大肠杆菌的KanR基因启动子在动物细胞中无转录活性,乳腺注射含KanR基因的重组质粒不会表达对奶牛和人体有害的Kan抗性蛋白。 相似文献
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人溶菌酶基因治疗奶牛乳腺炎的初步研究 总被引：38，自引：3，他引：35
将两种自行构建的表达人溶菌酶基因的重组质粒注射到患病奶牛的乳腺,经CMT试验证明对临床型和隐性乳房炎具有治疗作用。将其中的p205C3LYZ注射入奶牛乳腺,经微球菌溶解试验证明溶菌酶的表达量达到1．18μg／ml以上,表达至少维持8d。不同注射次数、剂量和途径的试验结果表明,重组质粒的治疗作用具有剂量和次数依赖性,3次注射450μg或2次注射400μg的治疗效果相当,乳房基部注射的治疗效果优于乳池注射。以CMT结果为主要指标的对比治疗试验结果表明,重组质粒对隐性奶牛乳房炎的治疗效果与青链霉素合剂接近,有效率分别为19／22(86．4％)和8／9(88．9％),优于中药乳炎消的治疗效果(9／13,69．2％)。3种药物治疗后,奶样中的细菌总数及葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌等代表性致病菌的数量有明显下降,重组质粒和抗菌素治疗组的奶产量上升幅度高于中药治疗组。结果表明,表达人溶菌酶基因的重组质粒对奶牛乳房炎具有可靠、持久的治疗效果,可以代替抗菌素使用。 相似文献
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在前期研究基础上,将经转座获得的杆状病毒重组穿梭质粒rBacmid-Rep、rBacmid-VP和rBacmid-LYZ共转染Sf9昆虫细胞,产生了表达人溶菌酶(hLYZ)的重组禽腺联病毒(rAAAV)(rAAAV-hLYZ);然后用纯化好的rAAAV-hLYZ溶液,在固体培养基上对常见病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、蜡状芽胞杆菌、白色念珠菌进行体外抑菌活性试验,研究重组禽腺联病毒介导的溶菌酶对临床病原菌的抑制作用。结果表明,溶菌酶基因能在重组禽腺联病毒中高效表达,这为进一步探索溶菌酶作为新型兽用生物药物奠定了基础。 相似文献