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如何把小干涉RNA有效地递送到体内特异的靶细胞是RNA干涉技术发展中的主要障碍。阳离子脂质体DC-Chol／DOPE已经成功地用于DNA药物的体内递送。研究表明DC-Chol／DOPE介导siRNA对HeLa细胞的转染与商品化的转染试剂Lipofectamine 2000一样高效，而对细胞的毒性则要小得多。 相似文献
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《东北农业大学学报》2015,(8)
文章模拟低密度脂蛋白制作阳离子固体脂质纳米粒,并评价其作为核酸疫苗载体的实用性。利用改进的溶剂乳化法成功制备LDL样固体脂质纳米粒(SLN)。SLN组成成分为胆固醇油酸酯(47%,W/W),甘油三酯(2%,W/W),DOPE(9%,W/W)、未酯化胆固醇(12%,W/W)、DC-胆固醇(30%,W/W)。结果表明,固体脂质纳米粒的平均大小为(98.96±0.24)nm,表面zeta电位为(+177±14.14)m V。相比聚乙烯亚(PEI),SLN在同等浓度下表现出相当微弱的细胞毒性。在最佳质量比值条件下,SLN和p EGFP-C2载体复合物(8.4??1)对体外培养细胞的转染能力得到大幅度改善,相比单用p EGFP-C2载体转染时强约10倍。以(p Shuttle-H1-荧光素酶sh RNA)/SLN复合物处理转荧光素酶基因的人肺腺癌细胞PC9时,复合物成功抵达细胞内并通过si RNA干扰途径显示出实质性的荧光素酶基因沉默现象。试验合成的LDL样阳离子固体脂质纳米粒颗粒大小均匀、表面正电荷稳定、细胞毒性甚微,可与p EGFP-C2真核表达载体结合,有效转染到细胞内。 相似文献
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【目的】猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种对养猪业造成巨大损失的高致死率的传染性疫病。CRISPR/Cas13b系统精准切割和编辑RNA的功能提供了一种靶向抑制RNA病毒的策略。本研究尝试利用CRISPR/Cas13b的RNA干扰功能对PEDV的基因组RNA进行切割,以探索一种新型的PEDV病毒抑制策略。【方法】设计了4对靶向PEDV基因组不同区域的CRISPR RNA(crRNA)位点,构建了CRISPR/Cas13b打靶载体,以打靶载体转染Vero细胞,并利用PEDV感染转染细胞,检测PEDV在CRISPR/Cas13b转染细胞内的增殖情况。【结果】CRISPR/Cas13b系统对PEDV在Vero细胞的增殖具有明显的抑制作用。打靶载体U6-crRNA3和U6-crRNA4转染组相较于正常细胞组,病毒免疫荧光试验中荧光团明显减少;定量PCR结果显示,打靶载体转染组在细胞水平抑制50%以上病毒增殖量。【结论】本研究构建的CRISPR/Cas13b系统能有效抑制PEDV增殖,为开发有效的RNA病毒防控手段、建立抗病动物模型提供了新的研究策略。 相似文献
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[目的]研究小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞cyclinA基因表达及细胞周期的影响.[方法]通过脂质体转染试剂将针对cyclinA基因的特异性siRNA片段转入家蚕BmN细胞,采用SYBR荧光定量PCR法检测cyclinA mRNA的表达,流式细胞技术检测细胞周期变化.[结果]转染siRNA-cyclinA可有效下调cyclinA基因的表达,转染48 h后,cyclinA mRNA表达量降低到对照的37.4％;流式细胞仪分析表明:与对照组相比,转染组Go/G1期细胞比例显著增加,细胞周期阻滞于G1期.[结论]靶向cyclinA基因的siRNA片段,通过下调cyclinA基因表达能有效抑制细胞增殖. 相似文献
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设计靶向EGFR mRNA的脱氧核酶(EGFR DRz)，以壳寡糖(COS)为材料，建立了一种有效的纳米基因细胞内传递体系，并研究其介导的靶向EGFR的脱氧核酶在Hela细胞内的生物学效应.流式结果表明COSEGFR DRz复合体转染效率为88.7%，与脂质体转染试剂的89.7%相比无显著差异.半定量RTPCR结果显示，经壳寡糖纳米载体递送的EGFR DRz能有效地靶向切割Hela细胞内的EGFR mRNA，使其表达下降.进一步的流式分析显示细胞被阻滞在G0~G1期，并且出现凋亡现象，其中COS组的凋亡率为19.3%，大于对照组脂质体的凋亡率13.0%.研究表明，COS较脂质体有相似的转染效率和更低的毒性，是一种潜在的、有效的脱氧核酶递送载体. 相似文献
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【目的】研究小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞CyclinE基因表达及细胞周期的影响。【方法】合成针对CyclinE基因1 252和568位点的siRNA片段,并利用脂质体法转染家蚕BmN细胞,于共聚焦荧光显微镜下观察转染情况;应用实时荧光定量PCR法检测CyclinE mRNA的表达情况,流式细胞仪检测细胞周期。【结果】siRNA对家蚕BmN细胞的转染效率达80%左右。转染1252-siRNA-CyclinE和568-siRNA-CyclinE 48h后,分别使家蚕BmN细胞CyclinE mRNA表达量降低了68%和90%;流式细胞仪检测结果显示,2个转染组G0/G1期细胞比例显著增大,S期和G2/M期细胞比例显著减小。【结论】在家蚕BmN细胞中导入针对CyclinE的siRNA,可有效抑制CyclinE基因的表达,使细胞周期阻滞于G1期,进而抑制细胞增殖。 相似文献
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虾青素对脂多糖通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路诱导的IPEC-J2细胞炎症的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】研究虾青素(AST)对脂多糖(LPS)通过TLR4/My D88/NF-κB信号通路诱导的IPEC-J2细胞炎症的影响。【方法】采用MTT法确定虾青素和LPS对IPEC-J2细胞和转染IPEC-J2细胞的最佳处理浓度和处理时间,在处理后采用实时荧光定量PCR检测IPEC-J2细胞和转染IPEC-J2细胞炎症因子NF-κB、TNF-α、IL-6和IL~(-1)β的m RNA相对表达量,采用ELISA检测上述炎症因子的分泌量。【结果】当处理3 h,虾青素浓度达到150μmol·L~(-1)时,IPEC-J2细胞和转染IPEC-J2细胞活力达到峰值;当处理6 h,LPS质量浓度达到100 ng·m L~(-1)时,IPEC-J2细胞和转染IPEC-J2细胞活力达到峰值。与对照组相比,LPS组IPEC-J2细胞NF-κB、TNF-α、IL-6、IL~(-1)β的m RNA相对表达量和分泌量显著升高(P0.05);与LPS组相比,AST+LPS组NF-κB、TNF-α、IL-6、IL~(-1)β在IPEC-J2细胞中的m RNA相对表达量和分泌量显著降低(P0.05),而在转染IPEC-J2细胞中的炎症因子m RNA相对表达量和分泌量均无显著变化(P0.05)。【结论】虾青素可以抑制细胞炎症反应,且对细胞的保护作用与TLR4/My D88/NF-κB信号通路相关。 相似文献
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《湖北农业科学》2015,(15)
根据乙型单纯疱疹病毒(HSV-2)UL54基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,将其定向克隆至真核表达载体p GPU6/GFP/Neo中,经脂质体介导转染HEK293细胞,倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率,MTT法检测HEK293细胞的存活率,RT-PCR检测UL54基因m RNA的表达,Western blot检测UL54基因编码蛋白质的表达,终点滴定法测定细胞上清液中的病毒感染滴度。结果显示,sh RNA1081能抑制UL54基因m RNA和蛋白质的表达,能显著降低子代病毒滴度,提高细胞的存活率。表明本研究构建的重组表达载体p GPU6/GFP/Neo-UL54 sh RNA能在HEK293细胞中表达,并抑制HSV-2复制。 相似文献
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线性聚乙烯亚胺(LPEI)是一类广泛用于核酸转染或药物传递的阳离子聚合物.为了进一步探究25 kDa LPEI的转染条件,通过凝胶电泳阻滞试验评估N/P,聚合pH及聚合时间对LPEI-DNA复合物形成的影响,继而利用大范围N/P的25 kDa LPEI对HEK293 T细胞进行绿色荧光蛋白表达质粒转染,转染48 h后通过绿色荧光细胞比例及MTT的统计分析,评估转染效率与LPEI造成的细胞毒性.结果表明, N/P的上升能增强LPEI-DNA的电泳阻滞;随着共孵育pH值从6～8升高, LPEI-DNA聚合逐渐减弱;随着共孵育时间延长, LPEI-DNA聚合逐渐增强,孵育1 h时达到饱和.随着体外转染HEK293 T细胞的N/P升高,转染阳性细胞比例逐渐升高,当N/P达到40～60时转染效率达到最高,进一步提高N/P后转染效率极显著下降(p0.01);随着N/P升高,细胞活力逐渐下降.结果表明, N/P, pH,聚合时间均可影响LPEI聚合核酸能力;综合考虑N/P对HEK293 T细胞转染效率及细胞毒性的影响,确定25 kDa LPEI转染细胞适宜的条件为N/P为40～60,聚合pH值为6.0,聚合时间为1 h. 相似文献
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【目的】建立口蹄疫病毒（FMDV）感染性分子克隆的体内拯救技术平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】将置于T7启动子下的FMDV Asia1/JS/China/2005株全长cDNA的真核重组质粒pFMDV-A经Not I线化后和表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,进行病毒体内拯救的研究。【结果】转染细胞盲传第3代48 h后出现致细胞病变（CPE）,第4代10 h出现典型的CPE。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的FMDV,而且存在分子标签,表明构建的FMDV全长cDNA分子克隆在BHK-21细胞内成功包装出FMDV。拯救毒与亲本毒对乳鼠的致病力（LD50）差异不显著,具有相似的生物学特征。共转染试验重复多次,均拯救到FMDV病毒。【结论】成功建立了基于质粒为基础的FMDV的体内拯救方法。 相似文献
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冬油菜新品系828－5－4－1－1是以西欧白菜型油菜Alimeas为母本、地方品种何家湾油菜为父本的种间有性杂交后代采用株系选择和集团混选相结合的方法选育而成。该品系株高124.9cm，千粒重2.75g，生育期280d，耐早性较强，越冬率达86%，为冬性中晚熟品种。该品系在1999年和2000年的10点（次）的区试中，折合平均产量1765.7kg/hm^2，较对照品种天油1号增产10.8%，适宜天水市及周边海拔1800m以下地区种植。 相似文献
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以廉价的吩噻嗪为母体,分别采用一次反应、二次连续反应和二次连续反应加氢化钠三种不同的方法有效地合成了脂溶性异辛基吩噻嗪,并运用傅立叶变换红外光谱、质谱、元素分析、核磁共振谱等手段进行了表征;研究表明采用第三种方法合成产率最高;这为高效合成脂溶性有机中间体进行了有益的探索。 相似文献
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唑醇类杀菌剂对植物的常见致病菌如鞭毛菌、担子菌、半知菌等均有很好的预防和治疗作用,在农药领域应用十分广泛。以对氯苯丙酮为原料,经Corey-Chaykovsky环氧化,再与1H-1,2,4-三氮唑缩合,合成了唑醇化合物2-(4-氯苯基)-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁醇。探讨了环氧化反应的关键因素,收率可达97.9%。对缩合反应条件进行了正交优化：以碳酸氢钠为碱催化剂,环氧化物、1H-1,2,4-三氮唑、碳酸氢钠的摩尔比为1.0∶1.5∶2.1,反应温度130℃,反应5 h,缩合收率可稳定在82.0%以上。 相似文献
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