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1.
【目的】应用RNA干扰技术,同时抑制大豆凝集素(Soybean agglutinin,SBA)和脂肪氧化酶(Lipoxygenase,Lox)基因在种子中的表达,改良大豆营养品质,为培育优质大豆材料奠定基础。【方法】根据RNAi原理,酶切获得Lox目的片段,构建以除草剂Bar基因为筛选标记、种子特异性启动子P7αP启动SBA和Lox双干扰的pCAMBIA3301-SBA-Lox(pSBA-Lox)干扰表达载体,并通过农杆菌介导法转化大豆(品种为吉农28),采用PCR、Southern杂交和实时荧光定量PCR对转基因植株进行检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定结果表明,双价RNAi植物表达载体pSBA-Lox构建成功。将其转入到大豆中,对转化植株进行PCR、Southern杂交检测,结果显示,外源基因以单拷贝形式整合到植物基因组中,并能遗传给后代。T1代转基因植株的实时荧光定量PCR分析显示,转基因植株中SBA基因和Lox基因在籽粒中的表达量比未转化受体植株均明显降低,SBA基因表达量降低了35.9%~47.2%,Lox基因表达量降低了32.8%~56.1%,而在幼嫩叶片中的表达量相比对照植株变化不大。【结论】获得了大豆凝集素和脂肪氧化酶表达量均明显降低的T1代转基因大豆。 相似文献
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大豆胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶基因双价RNAi表达载体的改造及转化 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】应用RNA干扰技术同时抑制大豆脂肪氧化酶(Lox)和胰蛋白酶抑制剂(KTi)基因的表达,改良大豆品质,培育缺失Lox和KTi的大豆新材料。【方法】应用RNAi原理,以双价RNAi植物表达载体pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi为基础,以植物表达载体pCAMBIA3301的质粒DNA为模板,利用CaMV35S启动子的上游引物和CaMV35S终止子的下游引物,PCR扩增含有除草剂抗性基因bar的整个表达原件,然后将其插入到pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi中,构建以除草剂为筛选标记的双价RNAi表达载体,并通过花粉管通道法转化至大豆吉农18、吉农28和吉农27 3个品种中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交、RT-PCR分子水平检测和除草剂抗性检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定以及测序结果表明,双价RNAi植物表达载体pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar构建成功。将其转入到大豆中,分别获得吉农18、吉农28、吉农27T1代籽粒47,25和86粒,以及T2代转基因植株50株。RT-PCR结果表明,转基因株系中脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂mRNA积累受到明显抑制。【结论】获得了转pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar的T2代转基因大豆。 相似文献
3.
【目的】通过RNAi策略抑制小麦籽粒ppo的表达,获得籽粒PPO酶活性低、白度高的转基因小麦新种质。【方法】构建了以小麦胚乳特异表达启动子1Dx5启动子驱动的籽粒ppo的RNAi载体pBAC47P-ppoIR,利用基因枪将该载体与含bar的表达载体基因枪共转化中优9507幼胚愈伤组织,获得T0转基因植株。通过分子鉴定（PCR、Southern杂交、半定量RT-PCR、Northern杂交）、酶活筛选和白度测定等方法对转基因植株及其后代株系进行筛选。【结果】获得了27株阳性T0转基因植株。转基因植株及其后代经PCR和Southern杂交检测表明,RNAi构件已经稳定整合到T1的12个株系中。半定量RT-PCR和Northern杂交结果表明有20株T2籽粒中ppo表达水平明显低于对照。对转基因T2灌浆期籽粒进行PPO同功酶活性分析表明,有6个株系的PPO活性有所减弱。对T4籽粒的面片白度测定表明,5个株系的白度均比对照有所提高,其中2个株系效果显著。【结论】RNAi技术的表达能抑制籽粒ppo表达,降低PPO同功酶的活性,明显提高小麦面片白度,从而为小麦面粉白度的改良、品质育种提供了材料。 相似文献
4.
【目的】深入研究尾叶桉(Eucalyptus urophylla)肉桂酰乙醇脱氢酶(CAD)基因序列中的关键片段并利用其进行木质素合成调控。【方法】采用生物信息学工具对EuCAD基因进行序列分析,根据编码蛋白保守结构域的分布情况进行筛选,获得一段44 bp关键序列用于构建RNA干扰载体并转化烟草,获得转基因植株并对基因表达水平、木质素含量等表型进行检测。【结果】获得28个转基因株系,转基因植株正常生长发育,与野生型无异,随机挑选3个株系进行检测,发现CAD基因表达水平均较野生型显著降低,以R1株系降幅最大,降至野生型的12.51%。对R1株系进一步检测发现,其茎部直径与野生型无异,但木质部厚度较野生型显著降低,其中第4节处降低11.75%,第6节处降低10.06%,茎部整体木质素含量较野生型降低15.26%。表明该RNAi片段显著抑制烟草中CAD基因表达并影响烟草木质素合成。【结论】通过序列分析筛选出的EuCAD基因小片段,可通过RNA干扰显著影响烟草木质素合成,为尾叶桉木质素合成调控研究提供了技术参考。 相似文献
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【目的】构建β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因具有功能性间隔序列的发夹结构（Intron-hairpin RNAi,ihp-RNA）的RNA干扰(ihp-RNAi)表达载体并转化大豆,为通过RNA干扰技术改良大豆的营养品质奠定基础。【方法】以大豆总RNA反转录获得的cDNA为模板,通过PCR扩增克隆了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的核心保守序列(400 bp),并将该片段的反义和正义片段插入到重组植物表达载体p3301P的种子特异性启动子7αp下游,将功能性间隔序列intron-SSR插入反义片段与正义片段之间,构建α′-亚基基因ihp-RNAi安全型表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,并进行PCR及双酶切鉴定。利用农杆菌介导法将带有p3301-PFNZ-α′-BADH 的菌株转化“吉农27”大豆植株,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,并对转基因植株α′-亚基基因的表达量进行RT-PCR。【结果】成功构建了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,利用农杆菌介导法转化大豆得到7株阳性转化植株;Southern杂交结果显示,外源基因以1～2个拷贝整合于大豆基因组中;RT-PCR检测表明,β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的表达被明显抑制。【结论】成功构建了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体,获得了α′-亚基基因被明显抑制的转基因大豆植株,为应用基因工程技术进行大豆品质改良奠定了基础。 相似文献
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烟草液泡转化酶抑制子基因调控马铃薯块茎低温还原糖累积的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】克隆烟草液泡转化酶抑制子基因，并在马铃薯中表达，从而抑制低温贮藏块茎还原糖积累，提高马铃薯加工品质。【方法】通过RT-PCR法分离Nt-VIF全长cDNA，转化马铃薯植株，PCR、Northern杂交和Southern杂交检测转基因植株，转基因植株块茎在低温和常温条件下贮藏30 d，分析转化酶活性与还原糖含量。【结果】克隆到Nt-VIF全长cDNA，35S调控下正向的Nt-VIF基因cDNA已经成功转入鄂马铃薯3号（E3）植株。转基因植株块茎在4℃和20℃贮藏30 d表明，VI活性受温度调节，高温贮藏块茎的VI活性显著低于低温贮藏的块茎，且高温条件下转基因块茎与对照无显著差异，而低温条件下转基因块茎的VI活性与对照相比下降幅度为22.7%（株系A-3）～78.1%（株系A-31）。转基因块茎还原糖（RS）含量在高温贮藏条件下与对照差异亦不明显，而低温贮藏条件下RS含量下降幅度为20%（株系A-17）～80.5%（株系A-30）。进一步分析还表明，转基因块茎低温贮藏其液泡转化酶活性与还原糖含量呈显著正直线相关（RS = 0.289VI + 0.0736）。【结论】Nt-VIF基因的表达显著抑制了马铃薯液泡转化酶活性，导致还原糖积累降低。 相似文献
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【目的】创造块茎高支链淀粉或纯支链淀粉含量的转基因马铃薯材料。【方法】以构建的由Patatin启动子驱动的pBI121g-PgABI为干扰表达载体,采用农杆菌介导法转化马铃薯优良品种甘农薯2号。用PCR、Southern blotting、半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术检测转基因植株,并对转基因植株的微型薯进行淀粉含量的测定。【结果】通过农杆菌介导法获得10个转基因株系。PCR和Southern杂交结果证明,目的基因已被整合到基因组中,通过半定量RT-PCR分析表明,转基因株系中GBSSI的表达均受到明显抑制,且在6个转基因株系中检测不到mRNA的表达。进一步通过real-time PCR分析表明,转基因株系中GBSSI的mRNA沉默效率为66.27%—93.53%;转基因株系微型薯的淀粉含量也发生明显变化,其支链淀粉含量高达90.16%—98.84%,比对照高出10.31%—20.92%。转基因株系GBSSI的mRNA沉默效率与支链淀粉含量呈显著正相关（r=0.937,P<0.01）。【结论】采用ihpRNAi技术可有效抑制马铃薯块茎中内源GBSSI表达,获得高支链或纯支链淀粉含量的马铃薯材料。 相似文献
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用反义RNA技术创造高直链淀粉玉米材料 总被引：3，自引：0，他引：3
【目的】利用反义RNA技术调控玉米淀粉的生物合成过程,创造高直链淀粉玉米材料。【方法】克隆玉米淀粉分支酶(sbe2a)基因片段,以载体pWGLL为基础,构建高效反义表达载体,通过花粉管通道法将其导入玉米自交系铁7922中。【结果】获得了4株转基因株系,GFP表达检测、PCR扩增和Southern杂交结果表明,目的基因已整合到基因组中,且能够遗传。对4株转基因植株进行RT-PCR和淀粉分支酶活性检测,结果表明转反义sbe2a玉米淀粉分子酶基因的转录受到了明显抑制,淀粉分支酶活性明显低于野生型,相差最多的降低79.4%;直链淀粉含量也发生明显的变化,最高的提高了84.3%,且总淀粉含量与对照之间基本没有差异。【结论】采用反义RNA技术通过沉默内源sbe2a,可获得高直链淀粉含量的玉米材料。 相似文献
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TrxS基因的表达及其对大麦种子淀粉酶活性的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】分析TrxS基因对大麦种子发芽及淀粉酶活性的影响,为TrxS基因对大麦种子代谢的调控提供了理论依据。【方法】以转TrxS基因啤酒大麦株系为材料，从分子水平和生理指标进行分析。【结果】实时荧光RT-PCR检测证明TrxS基因在RNA水平上能够表达；转基因大麦籽粒α-淀粉酶和β-淀粉酶活性明显提高，发芽1-5d转基因大麦种子α-淀粉酶活性比对照分别增加5.86%、75.24%、118.51%、71.02%和22.99%，β-淀粉酶活性分别比对照增加19.29%、14.68%、35.47%、23.62%和2.67%；种子的发芽能力提高。【结论】TrxS基因能够促进种子发芽。 相似文献
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利用RNAi抑制B-hordein合成降低大麦籽粒蛋白质含量 总被引：3，自引：1，他引：2
【目的】通过RNAi策略抑制大麦籽粒B-hordein的表达,获得高氮肥水平下籽粒蛋白质含量降低的转基因大麦新种质,探索大麦品质改良新途径。【方法】采用同源PCR技术克隆大麦B-hordein核心保守序列,通过Gateway技术构建大麦B-hordein的RNAi植物表达载体pBract207-zz-gp4,利用农杆菌介导法转化大麦Golden Promise幼胚,获得转基因植株。通过PCR检测、Southern杂交验证RNAi构件在转基因大麦及其后代基因组的整合情况。采用半定量RT-PCR分析转基因大麦花后不同发育时期B-hordein转录表达情况。基于近红外谷物分析仪测定蛋白质含量,并进行醇溶蛋白SDS-PAGE检测,以筛选蛋白质含量降低的转基因大麦株系。开展氮肥运筹相关试验,检验RNAi效率及高氮肥水平下转基因大麦蛋白质含量变化情况。【结果】获得大麦B-hordein片段2条（Gp4和Gp5）,测序结果表明该片段大小为349 bp,聚类分析表明该序列跟已知大麦醇溶蛋白基因同源性最高达92%,与该基因已登录的mRNA序列同源性高于98%,确认所得片段为大麦B醇溶蛋白基因片段。利用Gateway技术将Gp4片段正反向插入载体pBract207,反向重复序列用i18 和 iv2 intron连接,构建了Ubi启动子驱动的大麦B-hordein RNAi植物表达载体 pBract207-zz-gp4。通过农杆菌介导转化大麦Golden Promise幼胚,结合目标基因及筛选标记基因的PCR验证,获得含有RNAi构件及筛选标记基因的转基因大麦株系11个。Southern杂交检测表明RNAi构件已经稳定整合到T2/T3转基因大麦基因组。随机选取6个T3转基因大麦株系,半定量RT-PCR结果表明花后不同发育时期转基因大麦籽粒B-hordein表达水平明显低于非转基因对照,20 d时转基因株系表达量不仅相比同期对照降低28.19%-55.19%,而且在各时期中也最低。利用随机选取的T1和T3籽粒进行蛋白质含量测定表明,8个转基因大麦株系的蛋白质含量相比非转基因对照显著降低,SDS-PAGE电泳结果显示与非转基因相比,转基因各株系B-醇溶蛋白比率有不同程度降低,其中3个株系B-醇溶蛋白比率降低明显,平均减幅为49.42%。采用蛋白质含量降低的转基因大麦株系RNAi-20开展氮肥运筹试验,结果表明,高氮肥水平HN2及HN3处理,该株系蛋白质含量显著低于非转基因对照;施以等量高氮肥时,伴随氮肥后移（HN2到HN3）,该株系总蛋白含量相对非转基因对照逐渐降低。SDS-PAGE电泳结果显示B醇溶蛋白含量降低,电泳带型发生变化。【结论】RNAi技术能抑制籽粒B-hordein表达,降低B-醇溶蛋白含量,高氮肥水平下能显著降低大麦蛋白质含量。 相似文献
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[目的]为大豆的分子标记辅助育种提供理论依据。[方法]应用改进的等电聚焦凝胶电泳(IEF-PAGE)技术,对由不同脂肪氧化酶(Loxs)缺失类型亲本配置的5个大豆杂交组合F2代进行逐粒检测,鉴定其Loxs缺失类型。[结果]杂交组合0129和0124为一类,其F2代有4种表现型(-Lox2-、Lox1Lox2、-Lox2Lox3和-Lox1Lox2Lox3);0139和0155为一类,F2代有6种表现型,分别为-Lox2、-Lox3、-Lox2Lox3、N(正常)、H(Lox2杂合)和H-Lox3(Lox2杂合且Lox3缺失);0134单独为一类,F2代仅3种表现型,分别为-Lox2、N和H。Lx3/Lx1和lx3/lx1为显隐性等位基因,Lx2/lx2为共显性等位基因。[结论]杂合基因型在蛋白水平上的特异表达为筛选优异的种质资源提供了一种辅助手段。 相似文献
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水稻穗发芽调控基因OsVP1的RNA干涉载体构建及遗传转化研究 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】穗发芽是种子在收获前遇到阴雨潮湿环境时,在田间母体植株上发芽的现象,是水稻生产中的一个重要限制因素。水稻穗发芽的表现性状和玉米种子特异的viviparous1(vp1)突变体表型非常相似。VP1是种子成熟和休眠所必须的脱落酸信号转导途径中的重要转录因子,因此利用转基因技术研究水稻同源基因OsVP1的生物学功能对有效控制杂交水稻穗发芽的发生和危害具有重要意义。【方法】将水稻OsVP1片段导入到植物表达载体pHB,构建OsVP1的RNA干涉植物表达载体pHB-OsVP1RNAi;通过根癌农杆菌介导转入水稻品种日本晴,并获得阳性植株。【结果】半定量RT-PCR分析显示,转基因植株胚中的OsVP1表达量明显低于野生型日本晴植株;萌发试验表明,转基因植株T1种子的萌发速率与野生型日本晴相比有明显的提高。并且在外加不同浓度的脱落酸(ABA)处理的溶液中,与野生型日本晴相比转基因种子萌发速率所受到的抑制较小;同时,在转基因植株T2新收获的稻穗的萌发试验表明,转基因的稻穗出现了明显的穗发芽现象。【结论】水稻OsVP1的RNA干涉能够提高种子的萌发速率以及诱发稻穗的穗发芽。 相似文献
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双价抗虫转基因大豆抗苜蓿夜蛾分析(英文) 总被引：4，自引：1，他引：3
[Objective] The aim of the research was to analyze the resistance of binary insect-resistant transgenic soybean to Heliothis viriplaca.[Method]In this experiment, resistance analysis of the stabilized binary insect-resistant transgenic soybean to Heliothis viriplaca was conducted in lab and in field conditions.[Result] The results indicated that the leaves of insect-resistant transgenic soybeans T5-150 and T5-195 showed lighter damage than those of non-transgenic soybeans. Meanwhile, the Heliothis viriplaca larvae fed on leaves of these two transgenic soybeans were characterized by less leaf consumption, shortening survival day, slower development and less pupation.[Conclusion]It was concluded that insect-resistance of transgenic soybean to Heliothis viriplaca was increased dramatically and the research provided a reference for selecting binary insect-resistant transgenic soybean to Heliothis viriplaca. 相似文献
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Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]采用Taqman定量PCR技术检测转基因杂交大豆中外源,Ⅲ终止子基因的拷贝数。[方法]以大豆凝集素基因为内参照基因,以非转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,通过梯度稀释法分别求取了内参照基因和质粒DNA的cz值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程,并通过将得到的0值代入标准曲线方程求取了样品的拷贝数。[结果]内参照基因标准曲线方程为Y=-3．422x＋35．201,R^2=O．998;外源基因标准曲线方程为Y=-3．348x＋34．890,R^2=0．999。nos终止子基因及其下游边界序列在转基因杂交大豆中为单拷贝。[结论]为确定转基因大豆外源基因拷贝数提供了理论依据。 相似文献