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1.
甘蓝中硫氧还蛋白编码基因THL1的分子特性及表达研究 总被引：3，自引：0，他引：3
采用PCR和RT2PCR技术, 以‘E1’甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对THL1基因进行扩增克隆, 得到的片段长度分别为732 bp和455 bp。序列分析表明, 克隆的DNA和cDNA序列与甘蓝‘西园四号’THL1的DNA和cDNA同源性分别为97.9%和98.3%, 两条序列内含子的大小不同; 同时, 前者第2内含子不符合典型的GT2AG规则: 即第2个内含子3′端碱基为AT。将THL1基因cDNA序列定向克隆到原核表达载体pET-43.1a ( + ) , 构建融合表达质粒pET43.1a ( + ) -THL1, 在大肠杆菌BL21中表达出分子量为74kD的融合蛋白, 经胰岛素检测, THL1有氧化还原活性, 表明THL1在大肠杆菌中得到了正确表达。 相似文献
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阔叶猕猴桃果实GalDH cDNA 克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
以猕猴桃属植物中果实维生素C含量最高的阔叶猕猴桃(Actinidia latifolia Merr. ) 果实为试
材, 经RT2PCR扩增获得约110 kb的L - 半乳糖脱氢酶cDNA片段。生物信息学分析表明, 该cDNA片段长为997 bp, 最大开放阅读框为960 bp, 可编码319 个氨基酸残基, 命名为A lGalDH, GenBank登录号为EU525846, 核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物GalDH核苷酸、氨基酸序列间的同源性分别在76%和70%以上, 且具有醛酮还原酶的保守结构域。构建了其原核表达载体pET-A lGalDH并转化大肠杆菌BL21, 经0.1 mmol·L - 1 IPTG诱导, 获得具有较高活性的表达融合蛋白6 ×His-AlGalDH。经Ni-His亲和磁珠分离纯化, 获得单一的融合目的蛋白条带, 测定其酶活为120 pmol·min- 1 ·mg- 1。 相似文献
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为了在茄科植物中寻找新的高赖氨酸蛋白基因,以辣椒栽培种‘江蔬7号'的成熟花粉为材料,根据马铃薯和番茄中高赖氨酸蛋白基因的保守序列设计引物,通过RT-PCR技术扩增到一条长390 bp的cDNA片段,继而应用RACE技术克隆了一个辣椒高赖氨酸蛋白基因的全长cDNA,命名为Cflr（GenBank登录号：EU367999）。Cflr基因cDNA全长920 bp,5＇端有84 bp的非翻译区,3＇端具有完整的polyA尾,包含一个编码223个氨基酸的完整开放阅读框。Cflr基因与马铃薯和番茄高赖氨酸蛋白基因cDNA序列的同源性为50%～60%,氨基酸序列的同源性为40%～50%。该基因所编码的蛋白质中赖氨酸含量为21.2%,苏氨酸含量为10.3%,是目前已知赖氨酸含量最高的天然蛋白。半定量RT-PCR结果表明,Cflr基因在辣椒未成熟花药、成熟花粉、花瓣、茎、叶片和根中均有表达,在成熟花粉和花瓣中的表达丰度最高,在叶片中表达量明显减少,而在未成熟花药、茎和根中的表达量极少。 相似文献
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砂梨果实ACC氧化酶cDNA克隆及其反义表达载体构建 总被引：3，自引：1，他引：2
利用RT-PCR和RACE技术从'早生新水'砂梨成熟果实cDNA中克隆出ACC氧化酶基因保守片段及其5'和3'端,拼接后获得砂梨果实ACC氧化酶cDNA全长。该cDNA全长1 225 bp,将其命名为Pyp-ACO,GenBank登录号为EF451060。Pyp-ACO核苷酸序列有一个945 bp的开放读码框,5'端非翻译区为63 bp,3'端非翻译区为217 bp,与西洋梨和苹果的编码区核苷酸序列有较高的相似性,分别为98.3%和98.1%。Pyp-ACO推导编码314个氨基酸,该序列具备非血红素二价铁离子依赖型的氧化/加氧酶类的12个保守氨基酸和催化活性所需的3个氨基酸。将Pyp-ACO编码区序列反向插入pYPX145载体,构建了由双35S启动子所控制的双元表达载体,同时已成功将表达载体导入根癌农杆菌菌株LBA4404,为耐贮藏转基因梨选育奠定了基础。 相似文献
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成熟猕猴桃果实中乙烯受体基因Ad-ETR2的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
在分析GenBank登录的植物乙烯受体家族氨基酸和核苷酸保守区序列基础上,设计简并引物,通过RT-PCR扩增出1个657bp大小的cDNA片段,测序结果表明,该片段穴Ad-ETR2雪编码219个氨基酸,它与其它植物乙烯受体核苷酸同源性为79.9%～86.5%,氨基酸的同源性为85.4%～95.9%,序列分析推断该基因片段可能是与番茄Le-ETR1结构和功能类似的一类乙烯受体。 相似文献
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马铃薯GLDH基因的克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
以马铃薯品种‘Favorita’叶片中的cDNA为模板,采用RT-PCR、巢式PCR、3′RACE和5′RACE技术,获得了L–半乳糖酸–1,4–内酯脱氢酶（EC 1131213,GLDH）基因cDNA 2 563 bp的全长序列,命名为StGLDH（GenBank：FJ755844）。序列分析表明,该基因编码区长1 773 bp,编码590个氨基酸,与其他植物GLDH氨基酸序列具有很高的同源性,尤其与番茄、辣椒、烟草GLDH 氨基酸序列具有90.6% ~ 95.9%的同源性。荧光定量分析表明,该基因在马铃薯不同器官中均有表达,在幼叶和功能叶中表达量最高,在茎中表达量最低;除匍匐茎外,其它器官中抗坏血酸（ascorbic acid,AsA）含量与StGLDH的表达高度一致。 相似文献
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为了给菊花 [Dendronthema ×grandiflora (Ramat.) Kitam.] 的转基因育种提供诱导型启动子,借鉴5′RACE策略,利用锚定PCR步移的方法克隆了甘菊 [Dendranthema lavandulifolium (Fisch. ex Trautv.) Makino] 甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase,BADH）基因的4个启动子序列,分别命名为DBP11、DBP12、DBP21和DBP22（GenBank登录号：DQ497620~DQ497623）,序列长度分别为1 230、1 249 、1 273 和574 bp。4个启动子序列对应区域的同源性在89%以上。其中DBP12和DBP21分別是甘菊BADH基因DlBADH1和DlBADH2（GenBank登录号：DQ011151和DQ011152）的启动子序列,DBP11和DBP22为甘菊BADH基因家族中其它成员的启动子序列。序列分析表明,上述启动子序列中均含有多处与水分胁迫和脱落酸诱导相关的顺式作用元件。在表达载体pCAMBIA1305.2的基础上,用所克隆的4个甘菊BADH基因启动子序列分别置换驱动其报告基因表达的35S启动子,建立了新的植物表达载体。用其转化农杆菌,并用叶盘法侵染甘菊,瞬时表达的结果表明,这些启动子序列均具备驱动报告基因表达的功能。 相似文献
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基于EST库的枳APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析 总被引：6，自引：1，他引：5
根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学方法以拟南芥APETALA2 cDNA序列作为模板,对柑橘EST数据库进行同源检索筛选,克隆了柑橘APETALA2基因的cDNA序列,并以枳[Poncirus trifoliata (L.) Raf.]花cDNA为模板,根据以上cDNA序列设计特异引物,利用RACE技术分别获得该基因的5'和3'末端,序列拼接后获得枳的APETALA2 cDNA全长。该cDNA全长为1 980 bp,命名为Pt-AP2。Pt-AP2核苷酸序列有一个1 539 bp完整的开放读码框(ORF),5'末端起始密码子ATG其始于290 bp,3'末端非翻译区为152 bp,其中含有27 bp的Ploy+(A)。该基因已在GenBank基因数据库注册,注册号为EU883665。推导该cDNA编码512个氨基酸,与苹果、矮牵牛和拟南芥中相应序列同源性分别为59.1%,59.7%和63.8%。序列分析表明, Pt-AP2除了具备完全保守的核定位信号序列（KKSR）外,还具有两个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR和SYBR Green I实时定量RT-PCR方法分析Pt-AP2在枳叶、茎、根、花和果等不同器官中的表达水平,结果一致表明Pt-AP2在各个器官中的表达水平不同, 花中的表达量最高,果实中的表达量最低。 相似文献
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猕猴桃成熟果实中脂氧合酶基因的克隆 总被引：11，自引：0，他引：11
采用ＰＣＲ扩增方法,从成熟猕猴桃果实组织中克隆到一个８２４ｂｐ的脂氧合酶（ＬＯＸ）基因片段（ｐＫＬＣ１）,该片段含有２７５个氨基酸组成的开放阅读框架,它与拟南芥菜、黄瓜、豌豆、土豆、水稻、大豆、烟草和番茄的核苷酸同源性为５９．０％～７４．６％,氨基酸同源性为６３．１％～７６．３％。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明,ｐＫＬＣ１片段为一低拷贝数基因家族所编码。 相似文献
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乙酰水杨酸调控猕猴桃果实后熟软化进程中的Ad-EXP1基因表达 总被引：1，自引：0，他引：1
以布鲁诺猕猴桃(Actinidia deliciosa cv.Bruno)成熟果实为材料,根据植物α-expansin(EXP)基因的氨基酸保守序列设计简并引物,利用RT-PCR方法结合3’RACE扩增得到1个长为957bp的cDNA片段(Ad-EXP1)。该基因片段编码211个氨基酸,与其它植物该基因核苷酸同源性为59%～85%,氨基酸同源性为73%～91%。Northern杂交结果表明,Ad-EXP1基因在采收当天的果实中表达很弱,随着果实成熟衰老进程加快趋于增强;乙酰水杨酸(ASA)处理延缓果实后熟软化和乙烯生成,也显著抑制Ad-EXP1基因表达。鉴于Ad-EXP1表达丰度与乙烯生成、果实软化程度的一致性,推测该基因在猕猴桃果实后熟软化进程中起着重要作用。 相似文献
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以拟南芥C-8, 7甾醇异构酶的氨基酸序列为信息探针搜索GenBank数据库, 对高度同源的马铃薯EST序列进行拼接、引物设计和RT2PCR扩增, 扩增产物测序结果证实获得一个马铃薯C-8, 7甾醇异构酶基因(StSI1) 的全长cDNA序列。序列分析结果显示, StSI1全长886 bp, 包含59 bp的5′非编码序列、161 bp的3′非编码序列和一个长度为666 bp编码221个氨基酸的开放阅读框, 分子量约为25 kD。氨基酸结构分析显示该蛋白的N端含有一个长度由35个氨基酸残基组成的信号肽, C端成熟肽区域含有典型的类EBP结合域。氨基酸比对分析表明, StSI1与已知C-8,7甾醇异构酶同源性介于32.9% ～61.3%之间, 与拟南芥AtSI1相似性最(61.3% ) 。RT-PCR 表达谱分析显示, StSI1在马铃薯的块茎芽眼和表皮组织中均能表达, 并且该基因的表达水平受贮藏温度升高和光照增强的正向调节。 相似文献
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猕猴桃病毒A和B的RT-PCR检测及分子变异初步研究 总被引：3，自引：0，他引：3
为明确猕猴桃病毒A（Actinidia virus A,AcVA）和猕猴桃病毒B（Actinidia virus B,AcVB）在中国猕猴桃（Actinidia sp.）上的侵染状况和分子特性,采用RT-PCR技术对151份猕猴桃样品的AcVA和AcVB进行检测,检出率分别为15.2%和17.9%,所收集的6种猕猴桃样品中均检测到一种或两种病毒。发现AcVA的ORF1、ORF4和ORF5扩增片段序列存在较大分子变异,不同分离物的269 bp片段（ORF1）核苷酸序列相似性为77.3% ~ 99.3%。在基于各扩增片段核苷酸序列的系统进化树中,AcVA分离物聚为2 ~ 3组。采用引物AcVB5F/5R扩增获得20个AcVB分离物的342 bp或338 bp的ORF5片段,核苷酸序列相似性为81% ~ 100%,与新西兰AcVB分离物TP7-93B相应片段的核苷酸序列相似性为83.9% ~ 99.7%,在系统进化树中聚为3组。 相似文献
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6个甜樱桃品种ACO基因多态性的检测 总被引：1，自引：0，他引：1
乙烯在植物果实成熟过程中起着重要的作用,ACC合酶(1-aminocyclop ropane-1-carboxylic acid synthase,ACS)和ACC氧化酶(1-aminocyclop ropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO)是植物乙烯生物合成途径的限速酶。通过DNA序列分析,以不同果实成熟期的6个甜樱桃品种(Prunus avium L.)为材料,检测ACO基因的多态性。获得甜樱桃ACO基因约1 kb,与桃(P.persica)ACO基因(GenBank登录号:AF532976)序列的同源性达96%,其预测的氨基酸序列与桃、梅(P.mume)、美洲李(P.armeniaca)和欧洲李(P.domestica)等ACO的氨基酸序列同源性超过95%。该片段包括4个外显子和4个内含子,内含子符合GT-AT规律。用DNAMAN进行多序列比对分别在内含子2和内含子4内发现2个多态性简单重复序列(AT)n。内含子2有3种片段:即(AT)6、(AT)7和(AT)8;内含子4有2种片段,即(AT)5和(AT)6,组合后共得到4种ACO单倍型。研究在甜樱桃ACO基因座上发现2个SSR标记,为进一步研究ACO基因多态性与果实成熟期相关性奠定基础。 相似文献
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以中国樱桃品种泰山干樱为试材,利用李属植物C2、C5保守区引物,扩增花柱S-RNase基因,获得4个S等位基因,测序结果表明序列大小分别为:1608、950、796、504bp。根据同源比较发现大小为796bp的等位基因与基因库中登录的S1-RNase为同一基因,其它3个S-RNase基因为首次报道,依序列大小分别命名为S2(1608bp,登陆号EF541168)、S4(950bp,登陆号EF541173)和S6(504bp,登陆号EF541172)。序列分析表明S2-RNase在C3区存在终止密码子,导致翻译提早终止;S4-RNase的C5区前有插入片断;S6-RNase在高变区比其它S等位基因少一个氨基酸残基。氨基酸序列同源性比较分析表明,中国樱桃S-RNase与樱花、扁桃的相似性高。在系统进化树中中国樱桃的4个S-RNase基因的氨基酸序列和樱花、扁桃、甜樱桃、酸樱桃等一起归于李亚科。 相似文献
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番茄S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因SlSAMDC1的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
以蔓陀罗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶全长cDNA序列为信息探针, 筛选NCBI番茄EST数据库, 依据同源EST信息,经人工拼接、RT-PCR及RACE技术验证,获得了1个新的SAMDC基因家族成员,命名为SlSAMDC1(GenBank登录号：EF550528),并利用染色体步移技术克隆了879 bp的上游调控区域。SlSAMDC1 cDNA序列全长1 847 bp, 5′-UTR和3′-UTR分别长523 bp、241 bp;存在3个ORF(微型uORF、小型uORF和主ORF),主ORF编码360个氨基酸的SAMDC酶原;SlSAMDC1基因组序列全长3 648 bp,有3个内含子,均位于5′-UTR,所有内含子的剪切位点均符合真核生物“GT-AG”规则。SlSAMDC1基因与其它植物来源SAMDC基因同源性较高,与人、大肠杆菌以及酵母的同源性较低。表达谱分析发现,SlSAMDC1基因在番茄根、茎、叶、花蕾、果实等器官中均表达,果实中的表达量相对较高。生物信息学分析表明,SlSMDC1基因的上游调控序列存在多个顺式作用元件,如W-box、TATA-box、CAAT-box等。 相似文献
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杧果乙烯受体基因MiETR1b的分离与表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
以‘紫花杧’杧果（Mangifera indica L.‘Zihua’）子叶切段为材料,采用RT-PCR结合RACE方法得到乙烯受体基因ETR1的cDNA及基因组DNA全长,命名为MiETR1b。该基因cDNA全长2 530 bp,开放读码框为2 220 bp,编码739个氨基酸;其基因组DNA全长4 116 bp,其中从起始密码子到终止密码子为3 305 bp,含有6个外显子和5个内含子。氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示MiETR1b与MiETR1亲缘关系最近,与CsERS1、DlETR1、TcERS1、PtrETR1有较高的同源性,且具有保守的GAF域和组氨酸激酶域。这些结果表明,MiETR1b为ETR1家族同源基因。荧光定量PCR结果表明,MiETR1b在杧果子叶切段不定根形成过程中在远轴端和近轴端都有表达,其中远轴端0.25 ~ 2 d的表达量显著上调;吲哚丁酸（IBA）和2,3,5–三碘苯甲酸（TIBA）预处理后分别在1 d和6 h显著下调。另一方面,在培养的初期,即0.5 ~ 1 d,乙烯释放量相对较高,4 d及其以后的乙烯释放量急剧下降,表明杧果子叶切段不定根形成过程中有较多乙烯生成,提示MiETR1b可能参与了不定根的形成。 相似文献