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1.
试验旨在研究氨基酸转运体钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白(the sodium-dependent neutral amino acid transporter 2,SNAT2)在牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cell,BMEC)中对氨基酸调节乳合成的影响。利用组织块法成功培养原代BMEC,添加不同氨基酸(蛋氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)和亮氨酸(Leu)刺激BMEC后,通过实时荧光定量PCR、Western blotting技术和甘油三酯试剂盒检测SNAT2、酪蛋白(β-casein)基因的表达量和BMEC培养液上清甘油三酯的分泌量;将N-flag-SNAT2真核表达载体及SNAT2siRNA分别转入细胞中进行SNAT2基因的过表达和敲低试验;通过Western blotting和甘油三酯试剂盒分别检测SNAT2、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin,mTOR)、β-casein蛋白表达量和BMEC培养液上清的甘油三酯含量。结果显示,3种氨基酸(Met、Lys、Leu)均能显著促进BMEC分泌乳蛋白和乳脂,并激活mTOR信号途径,其中Met、Lys还能够显著上调SNAT2基因表达;SNAT2能够正向调节BMEC乳蛋白和乳脂肪的合成,并激活mTOR信号通路,说明氨基酸激活mTOR信号通路是通过SNAT2基因介导完成的,进而调节了BMEC乳蛋白和乳脂肪合成。 相似文献
2.
本试验旨在研究m6A甲基转移酶（methyltransferase-like protein 3,METTL3）在奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMEC）中对乳蛋白和乳脂肪的调节作用。试验建立不同的BMEC模型,应用Western blotting、免疫荧光法检测添加雌激素（E）、蛋氨酸（Met）、METTL3超表达和抑制时对BMEC中乳蛋白和乳脂的影响,以及基因定位和表达变化。结果显示,当在BMEC培养液中添加E、Met及METTL3表达水平提高时,mTOR、p-mTOR、GlyRS、p-GlyRS、CSN2、SREBP-1c等表达量均增加,反之,这些基因表达量均下降,表明METTL3可以通过调控乳脂、乳蛋白的相关信号通路分子的基因表达进而影响乳脂、乳蛋白的表达。提示METTL3是乳合成的重要调节分子,可对细胞中乳脂、乳蛋白的合成起正调控作用。 相似文献
3.
钠离子依赖性中性氨基酸转运体2（SNAT2）是一种氨基酸转运蛋白，可转运中性氨基酸，广泛分布于多种细胞中。氨基酸既可作为蛋白质合成的底物，也是调节细胞新陈代谢的关键信号分子，但SNAT2是否介导氨基酸调节BMECs增殖和自噬尚未见报道。本研究利用CASY细胞计数和Western blotting技术检测SNAT2过表达和siRNA干扰后牛乳腺上皮细胞（BMECs）增殖情况以及SNAT2对自噬标志蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ表达量的影响，并利用免疫荧光检测细胞自噬斑点（LC3-Ⅱ）变化。结果显示，SNAT2过表达时，p-PI3K、p-mTOR和Cyclin D1表达量增加，反之，p-PI3K、p-mTOR和Cyclin D1表达量下降。SNAT2抑制时，LC3-Ⅱ表达量增加，免疫荧光检测自噬斑点增多。添加自噬增强剂海藻糖（trehalose，Tre）和蛋氨酸（methionine，Met）后，与单一添加Tre组相比，Met+Tre组p-mTOR表达量增加，LC3-Ⅱ表达量降低，胞浆内绿色自噬斑点减少；添加Tre和Met并抑制SNAT2时，p-mTOR表达量下降，LC3-Ⅱ表达量增多，胞浆内绿色自噬斑点增加。以上结果表明，SNAT2可介导Met通过调控PI3K-mTOR/Cyclin D1信号通路调节BMECs的增殖与自噬。 相似文献
4.
钠离子依赖性中性氨基酸转运体2(SNAT2)是一种氨基酸转运蛋白,可转运中性氨基酸,广泛分布于多种细胞中。氨基酸既可作为蛋白质合成的底物,也是调节细胞新陈代谢的关键信号分子,但SNAT2是否介导氨基酸调节BMECs增殖和自噬尚未见报道。本研究利用CASY细胞计数和Western blotting技术检测SNAT2过表达和siRNA干扰后牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖情况以及SNAT2对自噬标志蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ表达量的影响,并利用免疫荧光检测细胞自噬斑点(LC3-Ⅱ)变化。结果显示,SNAT2过表达时,p-PI3K、p-mTOR和Cyclin D1表达量增加,反之,p-PI3K、p-mTOR和Cyclin D1表达量下降。SNAT2抑制时,LC3-Ⅱ表达量增加,免疫荧光检测自噬斑点增多。添加自噬增强剂海藻糖(trehalose,Tre)和蛋氨酸(methionine,Met)后,与单一添加Tre组相比,Met+Tre组p-mTOR表达量增加,LC3-Ⅱ表达量降低,胞浆内绿色自噬斑点减少;添加Tre和Met并抑制SNAT2时,p-mTOR表达量下降,LC3-Ⅱ表达量增多,胞浆内绿色自噬斑点增加。以上结果表明,SNAT2可介导Met通过调控PI3K-mTOR/Cyclin D1信号通路调节BMECs的增殖与自噬。 相似文献
5.
试验旨在研究奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cell, BMEC）中NFκB1的表达与定位变化,以阐明NFκB1对BMEC乳合成的转录调节机理。通过组织块法培养原代细胞,利用BMEC和成纤维细胞对胰蛋白酶敏感性的不同进行纯化和传代;利用Western blotting和免疫荧光染色法检测细胞中角蛋白18和β-酪蛋白的表达以鉴定细胞的纯度和泌乳功能;通过添加0.6 mmol/L蛋氨酸建立氨基酸刺激BMEC泌乳的体外模型;Western blotting和免疫荧光法检测添加蛋氨酸后NFκB1和p-NFκB1表达与定位的变化。结果显示,获得了纯化的BMEC;Western blotting检测发现NFκB1在细胞浆中存在约141和105 ku两种形式,在细胞核中只存在105 ku形式;p-NFκB1（50 ku）主要存在于细胞核内。在添加蛋氨酸后NFκB1的141 ku形式的含量有一定增加;105 ku形式在细胞浆内蛋白水平变化不明显,在细胞核内水平明显升高;p-NFκB1在细胞核中的定位明显增加。结果提示,NFκB1参与BMEC乳合成的转录调节,氨基酸通过促进细胞核内NFκB1磷酸化以调节泌乳相关基因的转录和促进乳合成。 相似文献
6.
本试验旨在研究亮氨酸(Leu)对泌乳奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响,以探讨Leu对乳脂合成的影响机理。将第3代BMECs随机分为6个处理,每个处理6个重复。6个处理培养液中Leu浓度分别为0.45、0.90、1.80、2.70、3.60和7.20 mmol/L,37℃、5%CO2培养48 h后测定BMECs内甘油三酯(TG)的含量及乳脂合成相关基因和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)与固醇调节元件结合蛋白(SREBP1)蛋白的相对表达量。结果显示:Leu浓度对BMECs内TG含量无显著影响(P0.05)。适宜浓度的Leu显著促进脂肪酸合成酶(FASN)和乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)基因的表达(P0.05),FASN基因的相对表达量以1.80~2.70 mmol/L Leu处理、ACACA基因的相对表达量以1.80~7.20 mmol/L Leu处理较高。Leu浓度显著影响BMECs内SREBP1基因及蛋白表达(P0.05),以1.80 mmol/L Leu的促进效果最好。虽然Leu显著抑制BMECs内脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6)、线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM)和嗜乳脂蛋白亚家族1成员1(BTN1A1)基因的表达(P0.05),但只有高浓度(3.60~7.20 mmol/L)的Leu抑制作用较大。综合来看,Leu浓度影响BMECs乳脂合成相关基因及PPARγ和SREBP1蛋白的表达。Leu浓度为1.80~2.70 mmol/L时,对脂肪酸从头合成相关基因及调控因子SREBP1蛋白表达的促进效果较好,对TG合成及脂滴形成相关基因表达的抑制作用较小。 相似文献
7.
为了研究4F2hc在奶牛乳腺中的表达模式及调控方式，进一步明确氨基酸在奶牛乳腺上皮细胞中的跨膜转运过程，本研究采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测了4F2hc在泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织中的表达变化；在体外培养的泌乳期奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸，采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测其对奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达的影响；采用雷帕霉素抑制剂抑制mTOR信号通路，使用Western blotting方法检测mTOR信号抑制后奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达以及乳蛋白合成的变化。结果显示，在泌乳期的奶牛乳腺组织中4F2hc的mRNA和蛋白表达水平均显著或极显著高于干奶期（P<0.05，P<0.01）；在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸可以极显著提高乳腺上皮细胞中4F2hc的mRNA和蛋白质表达水平（P<0.01）；亮氨酸刺激可以激活细胞内的mTOR信号通路（P<0.05），而雷帕霉素处理则可以显著抑制mTOR信号分子的磷酸化并极显著抑制亮氨酸诱导的4F2hc的表达（P<0.05，P<0.01），进而极显著抑制β-Casein的合成（P<0.01）。以上研究结果表明，4F2hc基因的表达与奶牛乳腺的泌乳活性之间呈正相关，亮氨酸可以通过激活mTOR信号通路来调节4F2hc基因的表达，进而影响乳蛋白的合成。 相似文献
8.
本试验旨在研究蛋氨酸(Met)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响,以探讨Met对乳脂合成的影响机理。将第3代BMECs随机分为6个处理(每个处理6个重复),培养液中Met浓度分别为0.13、0.26、0.39、0.52、0.65和0.78 mmol/L。在37℃、5%CO2条件下培养48 h后测定BMECs内甘油三酯(TG)的含量及乳脂合成相关基因和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)与固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)蛋白的相对表达量。结果显示:Met浓度对BMECs内TG含量无显著影响(P0.05)。0.52~0.78 mmol/L Met处理BMECs内脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)和PPARγ基因的相对表达量均显著高于其他处理(P0.05)。BMECs内脂蛋白脂酶(LPL)基因的相对表达量以0.26~0.39 mmol/L Met处理较高,显著高于0.65~0.78 mmol/L Met处理(P0.05)。脂肪酸合成酶(FASN)基因的相对表达量以0.39~0.52 mmol/L Met处理较高,且0.52 mmol/L Met处理显著高于0.13~0.26 mmol/L和0.65~0.78 mmol/L Met处理(P0.05)。Met浓度可显著影响SREBP1和乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6)基因及SREBP1和PPARγ蛋白的表达(P0.05),均以0.26 mmol/L Met处理的相对表达量最高。结果表明,Met浓度影响BMECs内脂肪酸摄取、从头合成的基因的表达及乳脂合成调控因子PPARγ和SREBP1的基因和蛋白的表达,Met浓度为0.26~0.52 mmol/L时对BMECs内脂肪酸从头合成及长链脂肪酸摄取的促进效果较好。 相似文献
9.
本试验旨在研究赖氨酸(Lys)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂肪合成相关基因和蛋白表达的影响,探讨Lys影响乳脂肪合成的机理。将第3代BMECs随机分为6组,每组6个重复,每个重复1个培养孔。各组培养基中Lys的浓度分别为0.5(基础培养基,对照)、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0mmol/L,37℃、5%CO2培养48h后测定BMECs甘油三酯(TAG)含量、乳脂肪合成相关基因和蛋白的表达量。结果表明:BMECs内TAG含量(P=0.013)以及脂肪酸结合蛋白3(FABP3,P=0.001)、脂蛋白脂酶(LPL,P=0.096)、脂肪酸合成酶(FASN,P=0.003)、乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6,P=0.038)和甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM,P=0.022)基因表达量对Lys呈显著或趋于显著的浓度依赖效应。FABP3基因表达量以2.0、4.0、8.0、16.0mmol/L组和LPL基因表达量以1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L组显著高于0.5mmol/L组(P0.05);FASN基因表达量以2.0mmol/L组最高,显著高于16.0mmol/L组(P0.05);硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因表达量以2.0、4.0mmol/L组显著高于其他组(P0.05);磷脂酸磷酸酯酶1(LPIN1)、嗜乳脂蛋白亚家族1成员1(BTN1 A1)和黄嘌呤脱氢酶(XDH)基因表达量均以1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L组显著高于0.5mmol/L组(P0.05);过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因及蛋白表达量均以2.0、4.0mmol/L组显著高于0.5和8.0、16.0mmol/L组(P0.05);固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)基因表达量以1.0、2.0、4.0mmol/L组显著高于其他组(P0.05),蛋白表达量以1.0 mmol/L组显著高于其他组(P0.05)。但高浓度Lys抑制AGPAT6和GPAM的基因表达,AGPAT6基因表达量以2.0、4.0、8.0、16.0mmol/L组显著低于0.5、1.0mmol/L组(P0.05),GPAM基因表达量以16.0mmol/L组显著低于0.5、1.0、2.0、4.0mmol/L组(P0.05)。可见,Lys对BMECs的乳脂肪合成具有显著的促进效果,但高浓度的Lys抑制了乳脂肪合成相关基因的表达。本试验条件下,培养基中Lys适宜浓度为2.0~4.0mmol/L。 相似文献
10.
脂肪酸结合蛋白5（fatty acid binding protein 5,FABP5）是一种胞内脂质运载体。本试验应用甘油三酯测定法及BODIPY染色法检测奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cell,BMEC）中甘油三酯及脂滴分泌情况,采用实时荧光定量PCR、Western blotting技术检测BMECs中FABP5对固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）的表达影响。结果显示,试验成功获得高纯度的BMECs,构建了pGCMV-IRES-EGFP-FABP5真核表达载体,且与空白对照组和空载体组相比,FABP5过表达组的甘油三酯和脂滴分泌量极显著增加（P<0.01）,同时SREBP-1c及靶基因FAS、ACC的表达量均极显著增加（P<0.01）;试验成功筛选了FABP5 siRNA1为最佳干扰片段,当FABP5抑制时,抑制组的甘油三酯、脂滴分泌量极显著减少（P<0.01）,SREBP-1c、FAS、ACC的表达量均极显著降低（P<0.01）。表明FABP5可通过上调SREBP-1c的表达从而促进BMEC中乳脂的合成。 相似文献
11.
LI Dong HUANG Xin LI Shan-shan YU Meng-meng LI Meng ZHANG Ming-hui GAO Xue-jun 《中国畜牧兽医》2017,44(5):1267-1274
In this study,to investigate the regulatory role of methyltransferase-like protein 3 (METTL3) on milk protein and fat synthesis in bovine mammary epithelial cells (BMEC),different BMEC models were established, the expression of related genes and localization of METTL3 were detected,and the impact of METTL3 on milk protein and fat synthesis in BMEC after adding β-estrogen (E),methionine (Met),and overexpression or inhibition of METTL3 were measured using Western blotting and imunofluorescience methods. The results showed that when E and Met were added or the METTL3 expression was promoted,the expressions of mTOR,p-mTOR,GlyRS,p-GlyRS,CSN2 and SREBP-1c were increased,oppositely,the gene expression were decreased. Those results indicated that METTL3 could affect the milk fat and protein synthesis by adjusting the expression of related signaling pathway gene.METTL3 was one of the important regulating milk synthetic molecules and had an positively regulation on milk fat and protein synthesis in cells. 相似文献
12.
牛奶中乳蛋白和乳脂肪含量的高低直接关系到牛奶的品质和风味。牛奶中乳蛋白主要可以分为酪蛋白和乳清蛋白两种类型,其合成代谢过程均受到mTOR信号分子通路、JAK-STAT信号分子通路、GCN2-eIF2a信号分子通路的影响。牛奶中乳脂肪主要为三酰基甘油酯、磷脂等,对于牛奶的营养和风味均有重要影响,其受到脂肪酸相关酶ACACA、FAS、SCD1的调控。饲料营养是影响牛奶中乳蛋白和乳脂肪的关键因素之一,包括精粗饲料配比及饲料添加剂的应用等方面。本文对牛奶中乳蛋白和乳脂肪的合成调控机理,及日粮组成对其的影响机制进行阐述,为改善乳品质提供参考。 相似文献
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含蛋氨酸二肽影响奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成相关基因表达 总被引：1，自引：0，他引：1
本试验旨在研究含蛋氨酸(Met)二肽对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳蛋白合成相关基因表达的影响。试验分3部分,均采用单因子完全随机试验设计,Met的添加浓度及培养时间分别为60μg/m L(0.402 mmol/L)、48 h。第1部分,培养液添加8种含Met二肽[蛋氨酸-蛋氨酸(P-Met-Met)、蛋氨酸-赖氨酸(P-Met-Lys)、蛋氨酸-色氨酸(P-Met-Trp)、蛋氨酸-苯丙氨酸(P-Met-Phe)、蛋氨酸-苏氨酸(P-Met-Thr)、蛋氨酸-异亮氨酸(P-Met-Ile)、蛋氨酸-亮氨酸(P-Met-Leu)、蛋氨酸-缬氨酸(P-Met-Val)],以不添加二肽为对照,测定BMECs乳蛋白合成相关基因(αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、Ⅱ型小肽转运载体和氨肽酶氮)的表达量;第2部分,培养液添加8种与上述二肽对应的游离氨基酸(F-Met-Met、F-Met-Lys、F-MetTrp、F-M et-Phe、F-M et-Thr、F-M et-Ile、F-M et-Leu、F-M et-Val),以不添加游离氨基酸为对照,测定BM ECs乳蛋白合成相关基因的表达量;第3部分,用二肽等物质的量替代相应游离氨基酸,测定BMECs乳蛋白合成相关基因的表达量以及细胞内外氨肽酶含量。结果表明:P-Met-Met和P-M et-Lys组较对照组和其他二肽组上调了αs1-酪蛋白和β-酪蛋白基因的表达量,且P-M et-M et组优于P-Met-Lys组。F-Met-Met和F-Met-Lys组较对照组和其他游离氨基酸组显著提高了αs1-酪蛋白基因的表达量(P0.05)。除P-Met-Val和P-Met-Leu组外,其他二肽替代游离氨基酸后均不同程度地提高了乳蛋白和Ⅱ型小肽转运载体基因的表达量,其中P-Met-Met表现出较好的促进效果。总之,含Met二肽等量替代对应的游离氨基酸能够促进乳蛋白基因的表达,其中尤以P-Met-Met的效果最好。 相似文献
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The interaction between Leucine (Leu) and acetate affecting milk protein synthesis in the bovine mammary epithelial cells (BMECs), and underlying the molecular mechanisms are not well understood. The objectives of this study were to investigate the effect of Leu, acetate, and their interaction on the expression of genes involved in milk protein synthesis, and JACK2/STAT5, mTOR and AMP‐activated protein kinase (AMPK) signaling pathway. The study was a 2 × 6 factorial arrangement with treatments: Leu concentration (0.45 and 1.8 mM) and acetate concentration (0, 4, 6, 8, 10, and 12 mM). The results showed that 1.8 mM Leu or 8–10 mM acetate had positive effect on ATP content, the expression of casein genes, JACK2/STAT5 and phosphorylation of mTOR pathway, but reduced AMPK phosphorylation. Leu at 1.8mM had a positive effect on the up‐regulation of acetate on ATP content, the expression of CSN1S1, CSN2, CSN3, and JACK2, the expression and phosphorylation of eukaryotic initiation factor 4E, p70 ribosomal protein S6 kinase‐1, and mTOR, but reducing AMPK phosphorylation. The results suggest that acetate, Leu, and their interaction have effect on milk protein synthesis through the JACK2/STAT5, mTOR, and AMPK pathway. Acetate addition up‐regulated the effect of Leu on milk protein synthesis, and Leu facilitated the up‐regulation of acetate on milk protein synthesis through these pathways. 相似文献
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本试验旨在探讨催乳素对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)乳脂和乳蛋白合成相关基因表达的影响。选取中国荷斯坦奶牛BMECs为试验材料,经纯化培养后,培养基中添加不同浓度催乳素[0(对照)、100、300、500和1 000 ng/m L],继续培养24 h。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞活力;利用试剂盒检测胞内甘油三酯的含量;采用实时定量PCR法检测乳脂和乳蛋白合成相关基因的表达。结果表明:1)催乳素浓度为100、300 ng/m L时,BMECs相对增殖率显著高于对照组与其他试验组(P0.05)。2)与对照组相比,300 ng/m L催乳素能够显著提高BM ECs乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、二酰甘油酰基转移酶(DG AT)、脂肪酸结合蛋白3(FABP3)基因表达量及甘油三酯的含量(P0.05),硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因表达量有增加的趋势。3)与对照组相比,100、300 ng/m L催乳素能够显著提高哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)、催乳素受体(PRLR)基因表达量(P0.05);300 ng/m L催乳素能显著提高αS1酪蛋白(CSN1 S1)基因表达量(P0.05)。综上所述,100~300 ng/m L的催乳素对BM ECs乳脂和乳蛋白合成有较好的促进效果。 相似文献
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The fatty acid binding protein 5 (FABP5) is an intracellular lipid carrier. The TG GPO-POD assay kit and BODIPY staining methods were used to detect lipid secretion and triglyceride content,and the effect of FABP5 on SREBP-1c expression were detected by Real-time PCR and Western blotting methods. The results showed that high purity bovine mammary epithelial cells (BMECs) were successfully isolated and purified,and the eukaryotic expression vector pGCMV-IRES-EGFP-FABP5 was constructed in this experiment. Compared with the blank control group and empty vector group,the lipid secretion and triglyceride content, and the expression of SREBP-1c and FAS,ACC were extremely significantly increased when the FABP5 was overexpressed (P<0.01). FABP5 siRNA1 was selected as the optimal interference fragment, and when FABP5 was inhibited,the lipid secretion and triglyceride content,the expression of SREBP-1c,FAS and ACC were extremely significantly decreased (P<0.01).The results indicated that FABP5 could promote the synthesis of milk fat in BMEC by up-regulating the expression of SREBP-1c. 相似文献