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1.
根据Ovis aries interleukin(IL-2)序列设计1对引物,用PCR法扩增的目的基因进行克隆,将测序正确的IL-2基因片段和表达载体pPIC9K同时双酶切后相连,构建pPIC9K-IL-2重组表达载体.将线性化的载体pPIC9K-IL-2电转化毕赤酵母GS115,对重组酵母转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,用G418(4g/L)筛选到多拷贝菌株,进行不同条件下甲醇诱导表达.结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中,表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量约为18ku目的蛋白表达条带,本研究成功构建了高效表达重组羊IL-2毕赤酵母菌株,为新型细胞因子佐剂的研发奠定了基础. 相似文献
2.
根据甜味蛋白Brazzein基因成熟区的氨基酸序列,结合毕赤酵母的密码子偏爱性以及Brazzein蛋白质结构的相关研究,对甜味蛋白Brazzein基因进行改造,使表达的目的蛋白中包含3个突变氨基酸(29Asp→Lys,31His→Ala,41Glu→Lys)。采用重叠PCR(SOE-PCR)合成目的基因并克隆到pMD18-T载体,经测序鉴定,序列正确的质粒用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切。将回收得到的目的基因连接到经同样双酶切处理的pGAPZαA载体上,经PCR、酶切和测序鉴定,证明已成功构建pGAPZαA-Bra真核表达载体。将构建好的重组载体pGAPZαA-Bra用AvrⅡ线性化,电转进入巴斯德毕赤酵母中。筛选ZeocinTM阳性克隆菌,进行蛋白表达,SDS-PAGE结果表明蛋白表达成功。 相似文献
3.
黑曲霉A9葡萄糖氧化酶基因克隆及其酵母表达载体构建 总被引：1，自引：0，他引：1
以黑曲霉A9基因组为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)直接对葡萄糖氧化酶(GOD)基因进行PCR扩增,再将PCR产物克隆入pMD18-T载体,经DNA测序,该基因为1 743 bp,编码581个氨基酸。该基因序列已在GeneBank注册,登录号为DQ836361。用限制性内切酶切下目的基因,插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成表达载体pPIC9K-GOD。重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-GOD的构建,可望获得超量表达的高活性葡萄糖氧化酶,为研制高品质的酶制剂奠定基础。 相似文献
4.
为实现Exendin-4-Tβ4(以下简称Ex4-Tβ4)融合蛋白在毕赤酵母中的表达,采用重叠PcR法扩增出有Ex4-Tβ4融合基因.将其克隆入表达质粒pPIC9KH,采用毕赤酵母GSll5作为宿主菌,利用电转化法将重组载体pPIC9KH-Ex4-Tβ4转入GSll5中,利用甲醇作为诱导物,对重组栽体进行诱导表达,成功构建重组质粒pPIC9KH-Ex4-Tβ4,SDS-PAGE证明Ex4-Tβ4在毕赤酵母中能高效表达,成功地在毕赤酵母中表达了Ex4-Tβ4融合蛋白. 相似文献
5.
为了在毕赤酵母中获得牛气管抗菌肽(bTAP)的表达,根据已发表的牛气管抗菌肽序列和毕赤酵母对密码子的偏爱性设计2对引物,采用重叠延伸PCR法获得bTAP DNA序列,将其与毕赤酵母(Pichia pastoris)pPIC9K质粒连接,构建表达载体pPIC9 K-b TAP.用Sal Ⅰ酶切线性化pPIC9 K-b TAP质粒后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导其表达.SDS-PAGE分析结果表明表达的重组蛋白质分子量正确,抑菌试验结果表明表达的重组蛋白质bTAP对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果. 相似文献
6.
[目的]烟曲霉(Aspergillus fumigatus)壳聚糖内切酶基因(Chitosanase,EC.3.2.1.132)(csn)的高效表达研究。[方法]根据毕赤酵母密码子的偏爱性对壳聚糖内切酶的基因进行了优化,利用连续延伸PCR方法扩增全长csn基因,构建重组质粒pPIC9k-csn,将重组质粒pPIC9k-csn线性化后转化毕赤酵母GS115,分析重组蛋白的表达,测定其酶活性,并对其酶解产物成分进行分析。[结果]实现了密码子优化后的壳聚糖内切酶的高效表达,重组菌株比野生菌株所产的壳聚糖内切酶活性提高了近20倍。[结论]该研究成功实现了烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达,为工业化大规模生产壳聚糖酶奠定了基础。 相似文献
7.
利用RT-PCR克隆Ⅱ型大豆查尔酮异构酶基因(CHI1A),然后将目的片段与克隆载体pMD18-T质粒相连接,检测后将目的基因重组于粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的MCS序列之中,使用电击法将重组质粒转化进入粟酒裂殖酵母中,用PCR和双酶切的方法来检测试验结果,表明获得了CHI1A完整开放阅读框(670bp),与已报道序列(NO:AY595413)的同源性达到99%。PCR和酶切鉴定表明,CHI1A已导入到酵母表达载体中。查尔酮异构酶基因的克隆、粟酒裂殖酵母表达载体的构建,为该基因的应用提供了依据。有望利用基因工程技术将该基因重组于酵母基因组中并表达目的蛋白,以此来催化合成黄酮和异黄酮类化合物。 相似文献
8.
为了研究新型细胞因子制剂,构建鸡白细胞介素18和鸡干扰素γ的基因融合表达载体。无菌提取鸡脾细胞的总RNA,以其为模板经过RT-PCR的方法分别扩增出Ch IL-18和Ch IFN-γ基因片段,并连接到p MDTM18-T克隆载体上,构建重组质粒p MDTM18-T-Ch IL-18和p MDTM18-T-Ch IFN-γ。以重组质粒p MDTM18-T-Ch IL-18和p MDTM18-T-Ch IFN-γ为模板,利用多肽氨基酸接头和overlap技术,获得Ch IL-18-Ch IFN-γ融合基因并连接到克隆载体p MDTM18-T上,经PCR、酶切及测序鉴定正确后连接到p ET32a原核表达载体中。构建Ch IL-18-Ch IFN-γ原核表达载体。为下一步研究二者之间的作用关系及抗病毒功能奠定了基础。 相似文献
9.
用连接PCR合成出甜味蛋白Brazzein的基因,克隆到PUC 57质粒中测序后,用EcoR I 和Not I双酶切,连接到pPIC 9 k,电转化毕赤酵母GS 115,经MD和MM平板筛选,获得His+Muts重组子.0.5%甲醇诱导表达96 h后,对发酵液和细胞进行SDS-PAGE分析,在发酵液中没有蛋白带出现,在细胞裂解液中出现相对分子质量约6.0 kd的特异性甜味蛋白条带,与预期的相对分子质量大小相符.用BCA蛋白定量试剂盒测定,Brazzein在毕赤酵母中的表达量可达329 mg/L. 相似文献
10.
[目的]为Brazzein基因在酵母SMD1168中转化和表达奠定基础。[方法]利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)合成Brazzein基因,将其连接到pMD18-T载体上,构建克隆载体pMD18-T-Bra。分别用XhoI和XbaI限制内切酶对克隆质粒pMD18-T-Bra和酵母表达载体pGAPZαA进行酶切,并在T4DNA连接酶作用下,将回收的目的基因连接到pGAPZαA载体上,构建重组质粒pGAPZαA-Bra。[结果]通过PCR扩增获得了约188 bp的Brazzein类似物的编码序列,将其克隆到pMD18-T质粒,用XhoI和XbaI双酶切后,连接到pGAPZαA载体,成功构建了重组表达载体pGAPZαA-Bra。Brazzein基因其中各碱基未发生突变,整个表达载体阅读框正确无误。[结论]利用基因工程的方法生产Brazzein是可行的。 相似文献
11.
2003~2004年和2004~2005年冬季,在四川省攀西地区对霞多丽、佳美、梅尔诺、玫瑰蜜4个葡萄品种的休眠冬芽进行了破眠剂处理,以提高第2年葡萄枝条萌芽率。结果表明,在冬季气温最低时(1月10日左右)处理,4个葡萄品种的萌芽率均有提高;1.0%H2CN2+1.0%吐温80处理萌芽率提高最大;不同葡萄品种对破眠剂处理的反应不同,梅尔诺、佳美处理后萌芽率提高最大,与霞多丽、玫瑰蜜差异显著。 相似文献
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采用营养液水培,研究了外源H2O2对盐胁迫下黄瓜品种“津春2号”幼苗根、茎、叶中Na^＋和Cl^-含量的影响。结果表明：盐胁迫下黄瓜植株各器官中Na^＋含量升高,茎和叶中Cl^-含量升高,Na^＋和Cl^-主要在茎中积累;与单纯NaCl胁迫相比,NaCl＋H2O2处理的黄瓜幼苗根中Na^＋含量、根和茎中Cl^-含量均提高,叶中Na^＋和Cl^-含量降低,幼苗生物积累量增加,明显缓解了盐胁迫的伤害。 相似文献
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H2O2处理对木纳格葡萄冷藏期间品质及生理特性的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
为寻找新的安全、无污染的鲜食葡萄保鲜途径,以新疆特产木纳格葡萄为试材,研究了0.5%、1%、1.5%三个浓度过氧化氢溶液处理对葡萄果实在（0±1）℃冷藏期间果粒腐烂、果实硬度、可溶性固形物含量、果实可滴定酸含量、果实相对电导率及果实CAT、POD、PPO活性的影响。结果表明：用浓度为1%的H2O2溶液对葡萄果实进行浸泡处理,能有效降低木纳格葡萄冷藏期间的腐烂率,并可抑制果肉硬度、CAT活性的下降,提高果实的POD活性,降低PPO活性,对果实的可滴定酸含量及果实相对电导率无显著影响,提高了果实的贮藏品质。 相似文献
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重金属对大豆种子萌芽及在幼苗中迁移的影响 总被引：3，自引：0，他引：3
为探索重金属对大豆发芽、幼苗生长的影响及在根、茎、子叶中的迁移积累规律,以大豆为材料,采用无土栽培法研究了重金属Cu2+、Zn2+、Pb2+单一及复合处理对大豆种子萌芽、幼苗生长的影响和各重金属离子在大豆幼苗中的迁移情况.结果表明:1) 单一处理重金属离子浓度Cu2+≤25.0 mg/L、Zn2+≤25.0 mg/L和Pb2+≤10.0 mg/L时,大豆种子的发芽率和发芽势均高于空白试验,外源重金属低浓度对大豆发芽、幼苗的生长有利,高浓度有抑制作用.复合处理显示,Cu2+、Zn2+、Pb2+之间对大豆种子萌发和大豆幼苗的生长存在协同效应.2) 外源重金属单一处理时随浓度的增加积累量增大,迁移富集量表现为根＞茎＞子叶.复合处理时重金属离子在根、茎、子叶中的迁移富集量表现为根＞茎＞子叶,重金属离子对共存离子在幼苗根中的吸收和向茎、子叶迁移的量因共存离子不同而不同. 相似文献
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对马尾松热磨机械浆(TMP)进行了过氧化氢(H2O2)、甲脒亚磺酸盐(FAS)单段漂白以及H2O2-FAS两段漂白实验的研究。结果表明,H2O2漂白马尾松TMP较适宜的工艺条件为H2O2用量2.5%,NaOH用量1.3%,Na2SiO3用量2.5%,浆浓20%,温度80℃,时间60min;FAS漂白马尾松TMP较适宜的工艺条件为FAS用量2.5%,NaOH用量0.625%,浆浓15%,温度80℃,时间75min。H2O2、FAS单段漂白后纸浆白度分别为72.6%ISO和58.2%ISO,H2O2-FAS两段漂白后纸浆白度可达76.3%ISO。 相似文献
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过氧化氢(H2O2)是细胞有氧代谢的产物,在各种胁迫下产生量增加,不仅具有损伤生物大分子从而w伤害细胞的效应,还是一种重要的信号分子,通过诱导细胞内一系列防御基因表达和提高保护酶活性来清除活性氧,防止其在逆境条件下的过多积累从而保护植物免受伤害.H2O2参与多条信号转导通路的调控,在信号传导途径的上游,通过抑制蛋白磷酸酶活性、激活蛋白激酶活性、刺激Ca2 浓度增加、调节细胞的氧还状态等方式起到启动或增强信号的作用;在信号传导途径的下游,可以直接调节氧还敏感转录因子的氧还态,从而影响其活性. 相似文献
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通过种子萌发试验,研究了不同浓度的Pb2+和Cu2+对小麦种子萌发、幼苗生长以及对小麦α-淀粉酶活性的生态毒理效应.结果表明:Pb2+在低浓度下(＜0.5 mg·L-1)对小麦种子萌发、幼苗和根的生长有促进作用,但随着pb2+浓度的增大,此促进作用转变为抑制作用;Cu2+(＞5 mg·L-1)对小麦种子萌发过程中的各项指标皆为抑制作用;pb2+、Cu2+胁迫对小麦α-淀粉酶活性存在低浓度激活和高浓度抑制的效应,且浓度越高,抑制作用越强;Cu2+对小麦种子萌发各项指标的抑制率大于Pb2+,Pb2+、Cu2+对小麦根生长的毒害作用大于对地上部的影响. 相似文献
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目的:观察H2O2对人低分化鼻咽癌细胞(CNE-2Z)生长、增殖能力的影响,并探讨其可能机制。方法:用M TT及平板克隆形成实验、W estern B lot等检测H2O2诱导CNE-2Z后增殖能力、EGR-1、p53、p16、Cyclin D1的表达。结果:不同浓度H2O2可不同程度地抑制CNE-2Z细胞的生长增殖能力,同一时间点各实验组细胞抑制率相比差异有统计学意义,抑制率与H2O2浓度间表现出明显的剂量-效应关系。平板克隆形成实验的抑制率较M TT更明显。CNE-2Z无EGR-1、p16蛋白表达,可见p53、Cyclin D1蛋白表达;诱导培养后EGR-1、p53、Cyclin D1蛋白表达明显增加。结论:一定浓度的H2O2能抑制CNE-2Z细胞生长,其作用可能与EGR-1及p53蛋白表达增强有关;Egr-1基因在CNE-2Z中具有可诱导性,在肿瘤治疗中有一定的应用前景。 相似文献
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Cd2+和Cu2+对水稻土微生物及酶活性的影响 总被引：4，自引：0，他引：4
在实验室条件下，研究了重金属Cd^2＋、Cu^2＋对黄松水稻土微生物种群数量及酶活性的影响。结果表明，在试验所设置的浓度范围内，重金属对不同土壤微生物种群数量的影响差异较大。当Cd^2＋浓度0．5mg／kg时，对真菌、细菌和放线菌种群生长均具有促进作用；当Cd^2＋浓度1．0mg／kg时，对土壤真菌种群的生长仍具有促进作用，而放线菌和细菌种群的生长已受到明显的抑制作用；当Cd^2＋浓度1．5mg／kg时，土壤真菌种群生长也受到抑制。Cu^2＋对微生物种群生长的影响则以土壤真菌种群受抑制作用最强，在Cu^2＋的添加量为50mg／kg时，土壤真菌种群即受到抑制作用；细菌种群受抑制作用较弱。土壤微生物种群对Cd^2＋的敏感度为放线菌〉细菌〉真菌，对Cu^2＋的敏感度为真菌〉放线菌〉细菌。Cd^2＋、Cu^2＋对土壤酶活性的抑制作用表现为中性磷酸酶〉脲酶〉蔗糖还原酶〉过氧化氢酶。 相似文献