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1.
《畜牧与兽医》2017,(5):77-82
选取马立克氏病毒(MDV)去泛素化酶UL36蛋白N端具有蛋白酶活性的一段氨基酸序列,表达纯化并分析UL36的去泛素化酶活性特点。利用p Cold TF为表达载体,并在UL36-323的C端连接Strep tagⅡ作为纯化标签,构建重组质粒p Cold TF-UL36-Strep。应用大肠杆菌表达体系,低温诱导表达,并对该段蛋白进行纯化,得到可溶且纯度较高的蛋白后,通过Western blot确定所纯化的蛋白即是UL36蛋白。应用Di-Ub(K48)和SUMO1-GST作为底物鉴定其去泛素化酶活性。最终得到了可溶且纯度较高的UL36-323-Strep蛋白,并且通过酶切反应确定了其去泛素化酶活性,为进一步探究UL36在MDV感染及复制中的作用奠定前期基础,也为探究MDV的致病机理提供了必要的前提条件。 相似文献
2.
《畜牧与兽医》2020,(3):107-111
利用猪源小泛素化相关修饰蛋白可溶性表达猪腺病毒3型(PADV-3)的主要衣壳蛋白六邻体蛋白(Hexon)基因的高变区蛋白,为检测试剂盒和亚单位疫苗的开发奠定基础。本试验扩增出猪腺病毒3型的Hexon基因中的超变区(HVR_1～HVR_6)片段,并在其N端添加猪源的SUMO3的蛋白基因,连接到pET28a质粒,构建出pET28a-Hexon-HVR_(1-6)、pET28a-pigSUMO3-Hexon-HVR_(1-6)重组质粒,经过PCR以及双酶切验证并测序确认无碱基突变后,转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导进行表达,经超声波破碎后进行SDS-PAGE验证标签蛋白的促溶情况,将表达量最高的融合蛋白进行大量表达并纯化,Western blot鉴定分析。结果显示:在1 100 bp左右可见扩增出来目的基因片段;SDS-PAGE表明在32 kDa、37 kDa处可以看到目的蛋白,细菌破碎后发现SUMO3标签蛋白显著提高Hexon-HVR_(1-6)蛋白可溶性;免疫印迹结果显示融合蛋白可以被His_6标签的特异性抗体和PADV-3的阳性血清特异性识别。以上结果表明成功表达出了PADV-3的主要结构蛋白Hexon-HVR_(1-6),加入猪源的SUMO3标签后能显著提高重组蛋白的可溶性,且反应性和特异性良好。 相似文献
3.
VP2蛋白是传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的保护性抗原。原核表达中能否获得具有天然构象的可溶性VP2蛋白是研发IBD亚单位疫苗的关键问题。为了解是否存在鸡自体促溶标签蛋白以及外源促溶标签能否在一定程度上促进蛋白的正确折叠,试验对不同物种来源的类泛素蛋白修饰分子(small ubiquitin-like modifier,SUMO)进行比对研究。结果显示,获取到的3种鸡源SUMO蛋白与酵母源SUMO蛋白的氨基酸同源性均高于40%,其中SUMO-1与SUMO-3两种蛋白可以在大肠杆菌中可溶性表达;通过SUMO-1、SUMO-3与VP2蛋白的融合表达,证明了鸡源SUMO蛋白对VP2具有促溶效果,得到的重组菌株P-28A-s1-VP2和P-28A-Os3-VP2琼脂扩散效价均达到1∶16;经过纯化后,融合蛋白SUMO-1-VP2的琼脂扩散效价可达到1∶256;使用SUMO蛋白酶酶切融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot结果表明鸡源SUMO蛋白可以被成功切割,说明试验发现的鸡源SUMO蛋白可以作为促溶标签,在亚单位疫苗关键抗原表达中具有广阔的应用前景。 相似文献
4.
利用GST融合基因表达系统原核表达血管内皮生长因子D,并进行纯化。诱导重组质粒pGEX-VEGF-D在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经超声破菌后,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,并用3C-Protease酶切去标签GST,所得产物进行15%SDS-PAGE电泳。结果表明:大肠杆菌经诱导,高效表达出分子质量约56 ku的GST-VEGF-D融合蛋白;纯化后的蛋白经酶切后电泳显示只有一条带,纯度相对较高,可基本满足生物学活性测定,为研究VEGF-D蛋白的结构和功能提供了有利的条件。 相似文献
5.
为建立绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)的原核高效表达体系,本试验设计了扩增JSRV受体Hyal-2基因的特异性引物,应用PCR技术扩增出Hyal-2全长基因,将该基因定向重组于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,逐步优化条件至稳定表达,经Western blotting检测融合蛋白成功表达后,通过亲和层析法对融合蛋白进行纯化。结果表明,Hyal-2基因正确地插入到原核表达载体pGEX-4T-1中;经诱导含重组质粒pGEX-4T-1-Hyal-2的表达菌高效表达了带GST标签的目的蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白分子质量为80 ku,与预期大小一致,经Western blotting验证为带GST标签的融合蛋白;通过谷胱甘肽亲和层析法获得纯化的目的蛋白。本试验结果为进一步制备Hyal-2蛋白的多克隆抗体及深入研究其功能奠定基础。 相似文献
6.
旨在验证直接电穿孔重组蛋白PhiC31能否在鸡DF-1细胞中诱导PhiC31介导的基因盒交换。本研究通过原核表达和经亲和层析纯化获得SUMO-His-PhiC31融合蛋白，利用SUMO酶切除SUMO-His标签，获得天然的PhiC31蛋白。这两种蛋白先与pBCPB+质粒在试管内共孵育进行分子重组反应。之后，先将带有attPTT-DsRed2-attPCT片段的“着陆点”(landing pad, LP)质粒通过电穿孔导入DF-1细胞，然后进行第二次电穿孔，将带有attBTT-EGFP-HiBiT-attBCT的donor质粒连同PhiC31蛋白导入上述DF-1细胞，验证DsRed2-EGFP基因盒交换事件发生。结果显示，成功构建了原核表达载体pET-28a-SUMO-PhiC31,经IPTG诱导，该重组质粒在大肠杆菌中以可溶性方式表达SUMO-His-PhiC31融合蛋白，经亲和层析纯化，SUMO-His-PhiC31蛋白的产量达12 mg·L-1;该融合蛋白和切除SUMO-H... 相似文献
7.
为利用大肠杆菌表达系统高效表达抗菌肽Thanatin并避免其抗菌活性对宿主菌的影响,将抗菌肽Thanatin基因与家蚕核型多角体病毒多角体蛋白Polyhedrin基因融合克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)-Thanatin-polyhedrin,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达。SDS-PAGE检测显示经诱导表达的菌体中有与融合蛋白理论值(35 kD)相符的目的条带。凝胶扫描分析目的融合蛋白以包涵体的形式表达,且诱导后6 h融合蛋白的表达量最大,约占菌体总蛋白量的30%。纯化融合蛋白用盐酸羟胺切割后初步纯化获得具有抗菌活性的Thanatin蛋白。研究结果表明家蚕核型多角体病毒多角体蛋白能够作为抗菌肽Thanatin融合标签介导其高水平表达,有助于利用基因工程技术大规模生产抗菌肽Thanatin。 相似文献
8.
本文旨在构建抗菌肽parasinⅠ大肠杆菌重组表达载体,表达人工重组parasinⅠ,并检测其抑菌活性。根据parasinⅠ的成熟肽序列和大肠杆菌密码子偏好性,人工合成1段57 bp的基因编码cDNA,通过PCR技术构建大肠杆菌重组表达质粒pET32-ParaⅠ,并在parasinⅠ基因5’-端引入Xa因子酶切位点。重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株后,在不同温度(37和20℃)条件下对阳性转化子进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果表明:IPTG成功诱导了1个21 ku的融合蛋白表达,重组蛋白占菌体总蛋白质的45%～50%。在低温条件下产生的融合蛋白主要以可溶性形式存在。可溶性重组蛋白经亲和层析纯化后,用Χa因子进行酶切,酶切产物经琼脂孔扩散法抑菌活性检测,结果显示其对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。本试验实现了parasinⅠ的重组表达,表达产物经Χa因子酶切后具抑菌活性。 相似文献
9.
UL36USP是马立克病毒UL36基因编码的蛋白UL36上具有去泛素化酶活性的N-端部分片段(UL36USP),本试验以提取MDCC-MSB1细胞的基因组为模板通过PCR获得目的基因,将UL36USP基因克隆入pMD18T载体,测序正确并酶切鉴定后,将目的基因亚克隆到pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-UL36USP。将重组质粒转化BL21(DE3)E.coli中,IPTG诱导表达并使用Ni-NTA Agarose亲和层析进行纯化得到目的蛋白。应用纯化后的UL36USP免疫獭兔制备多克隆抗体。使用昆虫细胞表达系统表达的UL36片段检测多克隆抗体的特异性。结果显示成功制备特异性的UL36USP抗体。 相似文献