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1.
【目的】克隆广西三黄鸡过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因,建立该基因的实时荧光定量PCR,为后续开展广西三黄鸡PPARγ基因组织表达谱及品种间表达差异研究奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的鸡PPARγ基因序列保守区域,用Oligo6．0软件设计合成1对引物,以广西三黄鸡脂肪总RNA为模板,用RT-PCR从广西三黄鸡克隆PPARγ基因。以携带PPARγ基因片段的重组质粒为标准品,建立基于SYBR GreenⅠ染料法的实时荧光定量PCR标准曲线。【结果】广西三黄鸡PPARγ基因的编码区序列（CDS）长1428bp,编码475个氨基酸;与GenBank已公布的鸡PPARγ基因（AF163811）参考序列比对,其同源性为99．7％,存在4个位点碱基突变,但均为无义突变。广西三黄鸡PPARγ基因的实时荧光定量PCR标准曲线方程为：y=-3．568x＋28．50,扩增效率为1．907,实时荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线峰单一。【结论】鸡PPARγ基因在进化中比较保守;建立的广西三黄鸡PPARγ基因实时荧光定量PCR是可行的。 相似文献
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《仲恺农业工程学院学报》2020,(2)
本研究旨在建立三黄鸡TLR4(Toll like receptor 4)基因的实时荧光定量PCR检测技术,为三黄鸡TLR4基因表达的定量分析提供基础.根据GenBank三黄鸡TLR4基因的保守区域设计引物,采用SYBR Green I染料建立荧光定量PCR方法,以阳性重组质粒为标准品建立标准曲线,并进行了溶解曲线分析.结果表明,本研究建立的三黄鸡TLR4基因荧光定量PCR方法具有快速、线性范围广及重复性高等特点,为三黄鸡TLR4基因的进一步研究奠定基础. 相似文献
3.
[目的]克隆广西巴马小型猪过氧化物酶增殖物激活受体γ基因(PPARγ),并确定其在不同组织中的表达情况,为后续研究该基因在猪支原体肺炎(MPS)中的作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR克隆广西巴马小型猪PPARγ基因,并进行BLAST比对分析及其推导蛋白的生物信息学分析;以实时荧光定量PCR检测PPARγ基因在18月龄广西巴马小型猪心脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、肌肉和脂肪中的表达情况.[结果]广西巴马小型猪PPARγ基因开放阅读框序列1515 bp,编码504个氨基酸.广西巴马小型猪PPARγ基因推导氨基酸序列与GenBank已发表的猪PPARγ基因(FJ436399.1)推导氨基酸序列同源性最高,达100.0%;而与牛(NM_181024.2)、人类(NM_005037.5)、猕猴(NM_001032860.1)、鼠(NM_001308354.1)和鸿雁(KJ019822.1)的同源性分别为92.9%、91.8%、91.5%、90.5%和83.5%,表明PPARγ基因高度保守.PPARγ蛋白分子量为57380.91 Da,理论等电点(pI)为6.88,不稳定系数49.26,脂肪指数为88.21,亲水性平均水平为-0.293,为亲水性蛋白,其二级结构主要是α-螺旋,占总数的39.09%.PPARγ基因在广西巴马小型猪大肠组织中的表达量最高,极显著高于其他组织(P<0.01),而在肾脏、心脏和肌肉组织中的表达量极低.[结论]PPARγ基因在18月龄广西巴马小型猪的各组织中均有表达,但不同组织中的表达水平存在明显差异,可能与其在不同组织中的功能差异有关. 相似文献
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[目的]建立针对鸡白介素6（IL-6）、白介素17（IL-17）和γ干扰素（IFN-γ）的实时荧光定量PCR检测方法,为细胞因子的定量检测及病毒致病机制的研究奠定基础.[方法]根据GenBank已发表的鸡IL-6、IL-17、IFN-γ和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因保守序列,设计并合成4对相应的特异性引物,以鸡胚成纤维细胞的cDNA为模板构建重组质粒,对退火温度、引物浓度等SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应条件进行优化,建立各基因的标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性试验.[结果]GAPDH、IL-6、IL-17和IFN-γ的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增效率分别是98.2％、99.2％、102.0％和100.8％,相应的标准误差为0.00666、0.00813、0.00365和0.00458.特异性试验结果显示各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰,敏感性试验结果表明各基因的检测下限均为100拷贝,重复性试验结果表明组内变异系数均小于2.00％.[结论]建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有敏感性高、重复性好、特异性强等特点,为快速检测和定量鸡源IL-6、IL-17和IFN-γ的表达水平提供了技术平台. 相似文献
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为利用实时荧光定量PCR技术研究中草药羊蹄有效化学成分合成相关基因表达情况,采用针对多糖、多酚植物样品的总RNA提取试剂提取高质量的羊蹄总RNA,随后运用反转录PCR方法克隆了羊蹄甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的部分c DNA序列,并以该序列为模板设计引物,采用实时荧光定量PCR验证其作为内源参照基因的可靠性。结果表明:获得的核酸序列长564 bp,编码188个氨基酸;推导的氨基酸序列与西伯利亚蓼、拟南芥、小麦GAPDH基因编码的氨基酸序列同源性分别为92%、90%和89%;扩增曲线和熔解曲线显示设计的引物可应用于实时荧光定量PCR扩增。羊蹄GAPDH基因的克隆为利用实时荧光定量PCR技术研究目的基因表达情况奠定了基础。 相似文献
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【目的】对广西三黄鸡和爱拔益加（AA）鸡的脂蛋白脂酶基因（LPL）进行克隆与蛋白质结构分析,为后期开展LPL基因表达与鸡肌内脂肪含量相关性研究及筛选出与优质肉质相关的分子遗传标记奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的鸡LPL基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增广西三黄鸡和AA鸡的LPL基因cDNA序列,经双酶切鉴定和序列测定比对分析后,应用生物软件进行蛋白质二级结构预测分析。【结果】成功获得广西三黄鸡和AA鸡的LPL基因编码区序列（CDs）,大小均为1473 bp,两者的同源性为99.4%;将广西三黄鸡LPL基因序列提交至GenBank获得序列号JX090309。相对于AA鸡,广西三黄鸡LPL基因CDs存在9个位点的碱基突变,其中碱基503T→C导致氨基酸168Val→Ala,606T→G导致202Asp→Glu,1066A→G导致356Thr→Ala,1277C→T导致426Ser→Phe,1420A→G导致474Arp→Gly,1432G→A导致202Glu→Lys,这6个位点为错义突变;第166、372和1305位点的碱基突变为同义突变。蛋白质二级结构预测结果表明,广西三黄鸡与AA鸡LPL的C端结构域存在空间构象差异。【结论】LPL基因突变引起的氨基酸组成变化及蛋白质二级构象改变,可能影响鸡肌内脂肪沉积,进而决定肉质的优劣,即LPL基因可作为研究广西三黄鸡肌内脂肪代谢的主要候选基因。 相似文献
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【目的】对广西三黄鸡和爱拔益加（AA）鸡的脂蛋白脂酶基因（LPL）进行克隆与蛋白质结构分析,为后期开展LPL基因表达与鸡肌内脂肪含量相关性研究及筛选出与优质肉质相关的分子遗传标记奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的鸡“也基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增广西三黄鸡和AA鸡的LPL基因cDNA序列,经双酶切鉴定和序列测定比对分析后,应用生物软件进行蛋白质二级结构预测分析。【结果】成功获得广西三黄鸡和AA鸡的LPL基因编码区序列（CDs）,大小均为1473bp,两者的同源性为99．4％;将广西三黄鸡LPL基因序列提交至GenBank获得序列号JX090309。相对于AA鸡,广西三黄鸡LPL基因CDs存在9个位点的碱基突变,其中碱基^503T→C导致氨基酸^168Val→Ala,^606T→G导致^202Asp→Glu,^1066A→G导致^366Thr→Ala,^1277C→T导致^426Ser→Phe,^1420A→G导致^474Arp→Gly,^1432G→A导致^202Glu→Lys,这6个位点为错义突变;第166、372和1305位点的碱基突变为同义突变。蛋白质二级结构预测结果表明,广西三黄鸡与AA鸡LPL的C端结构域存在空间构象差异。【结论】LPL基因突变引起的氨基酸组成变化及蛋白质二级构象改变,可能影响鸡肌内脂肪沉积,进而决定肉质的优劣,即LPL基因可作为研究广西三黄鸡肌内脂肪代谢的主要候选基因。 相似文献
8.
《安徽农业科学》2012,(19)
[目的]探讨PPARγ-2基因多态性与广西巴马小型猪2型糖尿病易感性的关系.[方法]利用高糖高脂日粮饲喂24头广西巴马小型猪,利用PCR方法扩增PPARγ-2基因外显子2部分序列,测定其空腹血糖和胰岛素(INS)含量并进行糖耐量试验.[结果]克隆的PPARγ-2基因外显子2部分序列存在1处SNP位点(19813A/G),有AG(7头)和AA(17头)2种基因型.AG型广西巴马小型猪的空腹胰岛素含量和糖耐量试验中60 min血糖值显著高于AA型(P＜0.05),而AG型广西巴马小型猪2型糖尿病发生率(71.4％)明显高于AA型(5.9％).[结论]广西巴马小型猪PPARγ-2基因外显子2的19813A/G多态性与2型糖尿病易感性有关. 相似文献
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鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：2，他引：0
【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20 μL ,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。 相似文献
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[目的]建立奶牛G蛋白偶联受体109A基因(GPR 109A)的实时荧光定量PCR检测方法,为开展奶牛产后脂类代谢紊乱及酮病发生机理研究奠定基础.[方法]根据GenBank中奶牛GPR 109A基因和卢-actin基因(内参基因)的mRNA保守序列设计合成两对引物,以奶牛肝脏组织cDNA为模板,PCR扩增目的基因后与载体连接构建重组质粒,以SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR进行扩增,绘制标准曲线,并对其特异性、敏感性、重复性等进行检验.[结果]GPR109A基因和β-actin基因的实时荧光定量PCR标准曲线方程分别为y=-3.309x+10.92(R2=0.9985)和y=-3.289x+9.794(R2 2=0.9997),扩增效率分别为101.0％和100.0％.特异性试验结果显示,GPR 109A基因和β-actin基因的溶解曲线峰单一,无引物二聚体和非特异性扩增产物生成;敏感性试验结果显示,线性扩增范围广,可检测到1.8×102个拷贝的GPR109A基因;重复性试验结果显示,各扩增反应的变异系数(CV)小于或等于1.7％.[结论]基于GPR109A基因建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等特点,可用于牛源性GPR109A基因表达量的快速检测和定量分析. 相似文献
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PepT1基因绝对荧光定量PCR标准曲线的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为研究PepT1 mRNA在鸡小肠的表达对于蛋白质消化吸收的影响,实验建立了PepT1基因绝对荧光定量PCR标准曲线。根据GenBank中PepT1的序列信息设计合成两对引物,引物一是克隆引物,用于从鸡小肠细胞中扩增出cDNA片段;引物二是荧光定量PCR引物,其长度包含于引物一中,用荧光定量PCR来检测基因的表达。通过克隆出PepT1基因282 bp部分片段并插入到PMD18载体中,从而构建出绝对荧光定量PCR标准曲线。从实验结果得出标准曲线的回归方程为Y=-3.205X+34.170,其回归系数R2=0.990,溶解曲线表现为单一的峰,通过对结果的具体分析,认为该方法可靠,特异性均较强,可成功构建目的基因的标准曲线。 相似文献
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[目的]克隆海岛棉品种新海15中单萜合成酶基因(GbTPS),研究其受黄萎病诱导的表达情况,为进一步研究该基因在棉花抗黄萎病中的功能打下基础.[方法]克隆Gb TPS基因的开放阅读框(ORF)全长序列,对其蛋白序列进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR及病毒诱导的基因沉默对其抗病性进行分析.[结果]通过PCR扩增得到一个全长为1761 bp的ORF序列,命名为Gb TPS(GenBank登录号:KP247548).生物信息学分析发现,该基因编码586个氨基酸,预测分子量为67.7 kD,等电点为5.79.系统进化树分析结果表明,GbTPS属于Tps-g亚家族.GbTPS基因经黄萎病菌诱导后,表达量在4~24h内显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于空白对照组.病毒诱导的基因沉默受黄萎病诱导后其病情指数为52.38,与对照组相比并无明显差异.[结论]GbTPS基因仅在棉花抗黄萎病的早期发挥积极作用. 相似文献
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[目的]克隆CsGPX基因并研究其与黄瓜抗病性的关系.[方法]采用RT-PCR技术克隆黄瓜CsGPX基因cDNA序列全长,并对其进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR的方法分析CsGPX基因在细菌性角斑病侵染0～96 h下的表达情况.[结果]CsGPX基因cDNA序列全长914 bp,包含一个513 bp的开放阅读框,编码170个氨基酸,该基因编码蛋白的相对分子质量约为19.02 kD,理论等电点是8.66,为亲水性蛋白,不具有跨膜结构,不含信号肽序列.实时荧光定量PCR分析表明,CsGPX在黄瓜叶中有表达.在黄瓜细菌性角斑病菌侵染下,该基因在黄瓜叶中表达增高,明显受黄瓜细菌性角斑病菌的诱导.[结论]CsGPX基因的分子鉴定为进一步解析该基因在黄瓜抗病机制方面的作用提供重要依据. 相似文献
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[目的]克隆石栗幼嫩叶片accD基因的全长cDNA序列,为今后利用该基因和提高油料作物种子含油量提供参考.[方法]根据已知植物麻疯树、蓖麻等accD基因的保守区域设计简并引物,以石栗幼嫩叶片为材料,利用简并PCR和RACE技术克隆accD基因的全长cDNA序列,扩增其编码序列.[结果]扩增获得的石栗accD基因全长cDNA序列长1789 bp,包含1509 bp的开放阅读框,可编码503个氨基酸,GenBank登录号为KC255250,并命名为amaccD.石栗accD基因序列经BLASTx比对后,发现其与巴西橡胶树、蓖麻和麻疯树氨基酸序列的同源性分别为90％、90％和89％.[结论]克隆获得的石栗accD基因全长cDNA序列与巴西橡胶树、蓖麻和麻疯树等具有较高同源性. 相似文献
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[目的]对陆川猪肌肉生长抑制素（MSTN）基因进行克隆及序列分析,为后期开展MSTN因表达与陆川猪肌肉生长发育及脂肪沉积的相关性研究奠定基础.[方法]根据GenBank中已发表的猪MSTN因序列（NM 214435）设计引物,以陆川猪背最长肌组织总RNA为模板,RT-PCR扩增MSTN因cDNA序列,扩增片段经纯化、克隆、鉴定和测序分析,并应用生物软件进行蛋白质二级结构预测.[结果]克隆得到陆川猪MSTN因编码区1128 bp,与GenBank已公布的约克夏、汉普夏、杜洛克、梅山猪、藏猪、广西巴马小型猪的基因同源性均在99.8％以上.陆川猪MSTN因第294位点存在特有的碱基G,但未引起氨基酸改变.蛋白质二级结构预测结果表明,陆川猪的MSTN成熟肽包含有α螺旋、β转角、延长线和无规卷曲4种二级结构元件.[结论]猪MSTN因高度保守,可作为研究陆川猪肌肉生长发育和脂肪沉积的候选基因之一. 相似文献
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[目的]了解广西草龟生长激素(GH)基因全序列结构特点及其与其他物种间的关系,为进一步研究GH基因的结构、功能、遗传变异规律及其与生产性能的关系提供科学依据.[方法]根据GenBank上已公布的黄喉拟水龟GH基因序列设计合成9对特异性引物,以广西草龟基因组DNA为模板进行PCR扩增,所获得目的片段经纯化、克隆、鉴定和测序后,用Vector NTI Advance 10软件将各扩增序列拼接,获得草龟生长激素基因全序列,并用DNASTAR软件MegAlign程序中的Alignment Report和NCBI的BLAST对草龟GH基因全序列进行同源性比对分析及构建基于GH基因编码序列的物种间亲缘进化树.[结果]广西草龟GH基因全长8538 bp,与黄喉拟水龟GH基因全长8517 bp相比,二者的同源性高达98%,其中有118个碱基发生突变,插入37个碱基,14个位点发生碱基缺失;与鸡、鸭、鹌鹑、鸵鸟、红树林蛇的同源性分别为88%、83%、87%、86%和84%.[结论]GH基因编码序列具有较高的保守性. 相似文献
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[目的]分离克隆马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长.[方法]根据其他松科植物α-蒎烯合成酶基因保守区域设计引物,扩增出基因的部分片段,再结合RACE技术分别扩增出基因3’端和5’端序列,通过序列拼接获得cDNA全长,结合生物信息学软件分析该基因编码蛋白的特性.[结果]马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长为2 103 bp,编码区1 980 bp,编码629个氨基酸,含有1个N端结构域、1个金属结合结构域和1个天冬氨酸富集基序（DDMYD）.[结论]该方法成功克隆了马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长序列,具有单萜烯合成酶基因的典型特征,序列提交至GenBank,获得登录号KF547035. 相似文献
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[目的]克隆小菜蛾表皮蛋白基因(Plutella xylostella cuticular protein,PxyICP),分析其序列特征和发育表达模式,为深入研究PxyICP在小菜蛾表皮形成中的生理功能提供科学参考.[方法]以小菜蛾为试验材料,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆PxyICP,以生物信息学方法对其序列特征进行分析,并采用实时荧光定量PCR研究PxyICP mRNA在小菜蛾不同发育时期中的相对表达量.[结果]克隆获得的PxyICP基因开放阅读框长531 bp,编码177个氨基酸,相对分子质量约18.90 kD,等电点为5.32.氨基酸序列分析结果表明,小菜蛾表皮蛋白第1~16位氨基酸是参与跨膜蛋白转移的信号肽,且该序列具有昆虫表皮蛋白CPR家族中RR-1型保守基序的典型特征.不同发育时期的实时荧光定量PCR分析结果表明,PxyICP在小菜蛾各发育时期的表达量不同,其中PxyICP在2、3和4龄幼虫、蛹和成虫中的表达量分别是1龄幼虫的2.43、0.51、0.63、3.19和12.32倍,以在成虫的表达量最高.[结论]成功克隆获得PxyICP基因,根据其发育表达模式推测PxyICP蛋白参与小菜蛾成虫表皮的硬化和黑化等生理过程. 相似文献
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根据NCBI上已公布的中华鲟D-loop基因、细胞色素b基因、12S rRNA基因的核酸序列设计出4对引物,经SYBR Green实时荧光PCR反应、熔解曲线分析和扩增片段克隆测序后,发现针对D-loop基因的F2 - R1引物能够高效、特异地实现对靶序列扩增,选择其作为中华鲟基因特异性扩增引物,建立中华鲟基因SYBR Green实时荧光PCR检测方法.所建立的中华鲟D -loop基因SYBR Green实时荧光PCR检测方法特异性好、可操作性强,具有较好的应用价值. 相似文献
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[目的]掌握三黄鸡线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)基因的生物信息学,为MAVS基因诱导表达及禽类固有免疫相关机制研究打下基础.[方法]根据GenBank中已公布的原鸡MAVS基因序列设计1对特异性引物,采用RT-PCR扩增三黄鸡MA VS基因,并应用相关生物软件进行序列分析及其蛋白结构预测.[结果]三黄鸡MAVS基因编码区(CDS)全长1926 bp,编码641个氨基酸,与GenBank中已发表的原鸡MAVS氨基酸序列(NP 001012911.1)比对,三黄鸡MAVS氨基酸序列在第440、488、506和606位存在4个氨基酸差异,分别为440A→T、488P→L、506I→L和606E→K.三黄鸡MA VS基因与原鸡的相似性最高,达99.0%;与日本鹌鹑的相似性次之,为91.0%;与斑马鱼的相似性最低,仅37.6%.三黄鸡MAVS蛋白分子质量为67.79ku,理论等电点(pI)为5.04,属于跨膜蛋白,无信号肽序列;其二级结构中折叠占0.5%,无规则卷曲占88.7%,螺旋占10.8%.[结论]三黄鸡MA VS基因序列表现出高度的保守性,可作为今后研究三黄鸡抗病毒机制的重要指标之一. 相似文献