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《林业工程学报》2017,(6)
发酵液中溶解氧浓度是好氧发酵过程中反映氧传质效率的综合指标,维持发酵液适宜的溶解氧浓度是实现好氧发酵成功的关键所在,搅拌转速和通风量是影响发酵液溶解氧浓度的重要参数。笔者研究了在3 L发酵罐中搅拌转速和通风量对里氏木霉发酵合成β-甘露聚糖酶的影响。试验结果表明,里氏木霉发酵β-甘露聚糖酶时搅拌转速对氧传质效率的影响大于通风量。以质量浓度为1 g/L的葡萄糖和21.95 g/L的微晶纤维素为碳源发酵合成β-甘露聚糖酶,当搅拌转速450 r/min、通风量0.3 m~3/(m~3·min)时,发酵过程中溶解氧浓度保持在20%以上,发酵120 h,β-甘露聚糖酶活力、β-甘露糖苷酶活力和菌体质量浓度达到最大值3.92 U/m L,0.033U/m L和6.56 g/L。因此,发酵过程中溶解氧浓度维持在20%以上可获得较高的β-甘露聚糖酶活力。 相似文献
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《林业工程学报》2021,6(5)
为提高酶法制备葡甘露低聚糖得率,并阐明其对肠道微生物增殖的作用,研究了不同碳源诱导物对甘露聚糖酶酶系组成以及葡甘露聚糖酶解过程中工艺参数对葡甘露低聚糖得率的影响,研究了葡甘露低聚糖对典型肠道微生物的增殖作用及其代谢产物。结果表明,微晶纤维素是里氏木霉合成甘露聚糖酶的最佳碳源诱导物,里氏木霉以10 g/L微晶纤维素为诱导物产酶,β-甘露聚糖酶活力为3.902 U/mL,β-甘露糖苷酶活力为0.019 U/mL,两者酶活比为205.4∶1.0。15 g/L葡甘露聚糖在甘露聚糖酶用量10 U/g、50℃、pH 4.8条件下水解8 h,葡甘露低聚糖得率可达73.70%,酶对葡甘露低聚糖的选择性为85.60%。以3 g/L葡甘露低聚糖为碳源的肠道微生物进行体外培养,结果显示长双歧杆菌等14种有益菌能有效利用葡甘露低聚糖进行增殖和代谢,产生短链脂肪酸,而平肠球菌等3种潜在致病菌几乎不能利用葡甘露低聚糖;长双歧杆菌(Bifidobaterium longum ATCC15697)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus B-4495)的增殖效果最好,分别增殖了27.0和19.5倍,生成的短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸和乳酸)浓度分别为(78.5±3.5)和(42.6±2.6) mmol/L。 相似文献
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《林业工程学报》2017,(2)
N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGase)是微生物几丁质酶系中不可缺少的一部分,近年来由于其在几丁质降解过程中的特殊作用而受到关注。笔者从凝结芽孢杆菌NL01基因组上克隆获得了1个假定的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因,长度为1 761 bp,编码586个氨基酸,蛋白质理论分子量为64.5 k Da,编码氨基酸序列与已报道的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶相似性仅为38%。将该基因克隆至表达载体pETDuet-1上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达,结果显示重粗酶具有N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力,经镍柱纯化获得纯酶的比酶活为74.3 U/mg。对重组酶酶学性质研究发现,该酶是一种新型耐高温N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶。最适pH为5.5,最适温度为75℃,pH和热稳定性较好,在pH 3.5~7.5范围内比较稳定,在不高于65℃条件下热处理30 min后,酶活力可以保持在70%以上。 相似文献
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Penidiella sp. HEY-1β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质 总被引：1，自引：0，他引：1
通过Penidiella sp. HEY-1发酵豆渣可制备产胞外β-葡萄糖苷酶(BGL)。粗酶液经过乙醇沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析等步骤后获得了凝胶电泳均一的BGL。通过SDS-PAGE测得其分子质量为65.5 ku。该酶反应的最适温度为60~70℃,最适pH值为3.0,在70℃以下及pH值2.0~8.0范围内均能保持稳定。Mn2+对酶有激活作用,而Na+对酶有抑制作用,其他金属离子对酶的活性影响不大。底物专一性实验表明,该酶可作用于对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(p-NPGlu)、邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(o-NPG)。作用于p-NPGlu和o-NPG的米氏常数(Km)值分别为0.434和0.411 mmol/L,酶促反应的最大速度(vmax)分别为1.0×10-3和3.3×10-4mol/(L.min)。 相似文献
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《西部林业科学》2019,(5)
β-1,3-葡聚糖酶是植物重要的防卫蛋白之一。采用同源克隆法,从16个紫花苜蓿品种的集群DNA中分离到3个苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因的部分基因组编码序列,分别对应于蒺藜苜蓿3个不同的β-1,3-葡聚糖酶基因,并命名为β-1,3-葡聚糖酶基因1、β-1,3-葡聚糖酶基因2和β-1,3-葡聚糖酶基因3。其中,β-1,3-葡聚糖酶基因2和苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因3及其蒺藜苜蓿对应基因与包括β-1,3-葡聚糖酶基因1在内的其他豆科同类基因遗传距离较大。序列变异分析显示,β-1,3-葡聚糖酶基因2的SNP位点间平均距离为255bp,DNA和氨基酸序列均非常保守,表明其在进化中受到了强烈的选择压力。β-1,3-葡聚糖酶基因1的SNP位点间平均距离虽然较小(31bp),但其全部21个SNP位点均为同义SNP,同时,测序片段仅发现了10个单倍型,远远小于其理论单倍型数目(2~(21))。这表明β-1,3-葡聚糖酶基因1的氨基酸序列高度保守,在功能上非常重要,少量单倍型的存在是为了调节其表达,以使苜蓿适应多种内、外部环境条件。 相似文献
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桑树景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因的克隆、原核表达与植物表达载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)是卡尔文循环过程中的关键酶.利用RACE技术得到景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因全长cDNA,命名为MSBPase(GenBank登录号;DQ995346).MSBPase全长为1 527 bp,该序列含有1个1 179 bp的完整开放读码框,编码393个氨基酸,蛋白质理论分子质量约为42.6 ku,等电点为5.85,其氨基酸序列与其他植物中已分离的SBPase有很高的同源性.对MSBPase编码的蛋白质(命名为MSBPase)进行结构预测分析表明,该蛋白富含无规卷曲(coil),高达64.29%,其次是α-螺旋(helix),为22.19%,而β-折叠(strand)只有13.52%.将MSBPase编码区插入原核表达载体pET30a( ),并转化到大肠杆菌菌株 BL21中,经过IPTG诱导,MSBPase融合蛋白在BL21菌株中成功表达.将得到的MSBPase编码区插入植物表达载体pBI121中,构建了MSBPase植物表达载体pBI121.SBP. 相似文献
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为了进一步研究杨树4CL基因,以毛白杨为材料克隆到一个新的毛白杨4CL3基因.生物信息学分析结果显示:该基因和其他4CL基因一样含有4CL基因家族2个保守框Box Ⅰ和Box Ⅱ.将4CL3基因连接至原核表达载体pQE30,表达纯化后测定其蛋白的比活力,结果显示:4CL3基因对不同底物表现出了不同的催化效率.对该基因的最适温度和最适pH值测定后发现:4CL蛋白的最适温度为40℃,最适pH值为8.5,且在pH =9.0时有60％的活力.采用HPLC-MS的方法,分析了4CL3蛋白对混合底物的催化情况,结果显示:在混合底物下,4CL3蛋白对4-香豆酸、阿魏酸和肉桂酸都表现较高的活力,而对芥子酸和咖啡酸没有活力. 相似文献
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设计带有EcoRV和XhoI酶切位点的上下游引物PCR扩增嗜热菌Dictyoglomus thermophilum DSM 3960的GH39家族的β-木糖苷酶Xln-DT编码基因,利用基因拼接技术将其重组至p ET-20b质粒中pelB信号肽基因的下游,重组质粒转化大肠杆菌表达宿主Escherichia coli BL21,构建分泌融合表达型基因工程菌pelB-Xln-DT。经异苯基-β-D-硫代半乳糖苷诱导,pelB-Xln-DT酶活为2.1 U/m L。粗酶液pelB-Xln-DT的最适温度为85℃,较原酶提高了10℃,最适p H为5.5,比原酶降低了0.5; pelB-Xln-DT在85℃下的热稳定性比原酶有了一定提高,保温1 h后酶活基本不变,保温2 h其剩余酶活为82.0%,而Xln-DT在85℃下保温1 h后其剩余酶活为70.4%;在p H 4.0～7.0的范围内,pelB-Xln-DT具有良好的p H稳定性。引入pelB信号肽后不但能够提高蛋白的可溶性表达,还能提高酶蛋白的热稳定性。以pelB-Xln-DT作为全细胞催化剂转化三七皂苷R1生成人参皂苷Rg1,研究了转化温度、转化时间、三七皂苷R1添加量、重复次数等因素对转化效率的影响。结果表明,全细胞催化剂用量1.0 U/m L,在温度37℃下,3 g/L的三七皂苷R1反应3 h后的摩尔转化率达到91.6%,重复利用10次后,转化率仍能达到46.7%,显示出pelB-Xln-DT良好的重复催化性能。 相似文献
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以角毛壳菌菌丝体为材料,构建cDNA文库并进行了部分表达序列标签(ESTs)的分析。文库的滴度为1.02×106pfu/mL,重组率为95.3%,插入片段平均长度大于1.2kb。在cDNA文库中随机选择克隆从5′端测序得到1219个高质量ESTs,拼接为804条独立基因。其中460条(57.2%)与NCBI中非冗余蛋白质库(NR)已知基因有不同程度同源性的代表已知功能基因,344(42.8%)条独立基因与NR库中基因没有显著同源性的代表未知功能新基因。从已知基因中鉴定出了降解粗纤维的基因:β-1,4-内切葡聚糖酶基因、β-葡萄糖苷酶基因、β-内切木聚糖酶基因、木糖苷酶基因、漆酶基因。 相似文献
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银杏IspF基因的克隆与功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RACE技术,从银杏中获得MEP途径中的第5个酶2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶(IspF)基因的全长cDNA,命名为GbIspF(GenBank登录号:EF062579).该基因cDNA全长为897 bp,包含720 bp的开放阅读框,编码239个氨基酸残基的蛋白,在GbIspF的N-端有一个长为59个氨基酸残基的质体转运肽;序列多重比对表明GbIspF与其他植物IspF同源.利用半定量RT-PCR对GbIspF进行组织表达谱分析,结果表明GbIspF在银杏根、茎、叶、果中均有表达,但表达量差异较大,在叶中表达量最高,在根中表达量最低.功能互补分析表明GbIspF能推动工程菌XL1-Blue pTrcGbIspF pAC-BETA超量表达β-胡萝卜素,在颜色互补平板上呈现β-胡萝卜素特有的橘黄色,证实GbIspF具有典型的IspF基因功能. 相似文献
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里氏木霉木聚糖酶XYNⅡ基因在毕赤酵母中的分泌表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法克隆到里氏木霉Rut C-30木聚糖酶(XYN Ⅱ)的cDNA序列.测序结果表明,XYN Ⅱ的cDNA基因开放阅读框长度为669bp,编码223个氨基酸,N端1～19个氨基酸为潜在的信号肤序列,删去潜在信号肽序列,将里氏木霉木聚糖酶的基因(xyn Ⅱ)构建到巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化到巴斯德毕赤酵母中,经G418筛选和PCR鉴定后的转化子用1%的甲醇进行诱导,对重组木聚糖酶活检测显示该基因能在毕赤酵母中表达有生物活性的XYNⅡ并分泌到胞外.发酵液中的酶活在诱导培养60h达到1.45IU/mL,最适酶解温度为50℃,最适pH值为6.0. 相似文献
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将长足大竹象幼虫肠道分为前中后三段,研究长足大竹象幼虫在不同pH值、不同温度的交互作用下不同段肠道中的不同纤维素酶的活性,为了探索其肠道中酶活的最佳pH值和最佳温度。结果表明:后段肠道的纤维素酶活性最高;外切-β-1,4-葡聚糖苷酶的酶活性的最适温区为50℃-60℃(0.03±0.005μmol·min~(-1)·mg~(-1)),最适pH值为5～6(0.02±0.005μmol·min~(-1)·mg~(-1));内切-β-1,4-葡聚糖苷酶的最适温区为50～60℃(0.023±0.05μmol·min~(-1)·mg~(-1)),最适pH值为4～7(0.025±0.005μmol·min~(-1)·mg~(-1));β-葡萄糖苷酶的最适温区为40～60℃(0.02±0.05μmol·min~(-1)·mg~(-1)),最适pH值为4～7(0.02±0.05μmol·min~(-1)·mg~(-1))。温度和pH值对昆虫肠道内纤维素酶活性的影响显著。 相似文献
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黑曲霉胞外耐高糖β-葡萄糖苷酶的分离纯化及部分特性研究 总被引：3，自引：3，他引：0
采用硫酸铵盐析、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析等步骤,从黑曲霉的发酵液中获得了凝胶电泳均一的两种β-葡萄糖苷酶。其中一种为耐高糖的β-葡萄糖苷酶,葡萄糖抑制系数(Ki)为41.01 mmol/L,纯化倍数和得率分别为56.7倍和22.66%。耐高糖β-葡萄糖苷酶单亚基分子质量为114.6 ku,以对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物时,米氏常数(Km)值和酶促反应的最大速率(vmax)分别为0.904 mmol/L和1.08μmol/min。该酶最适反应温度60℃,最适反应pH值为4.0;在60℃以下及pH值3~7范围内均能保持稳定。所测定的化学试剂中,Ag 对酶具有较强的抑制作用,其它金属离子及乙二胺四乙酸对酶的活性影响不大。甲醇、正丁醇有明显激活酶活性的作用,但乙腈、丙酮对酶的抑制作用明显。 相似文献
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采用RT-PCR方法克隆到里氏木霉Rut C-30木聚糖酶(XYN II)的cDNA序列。测序结果表明,XYN II的cDNA基因开放阅读框长度为669 bp,编码223个氨基酸,N端1~19个氨基酸为潜在的信号肽序列,删去潜在信号肽序列,将里氏木霉木聚糖酶的基因(xynII)构建到巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化到巴斯德毕赤酵母中,经G418筛选和PCR鉴定后的转化子用1%的甲醇进行诱导,对重组木聚糖酶活检测显示该基因能在毕赤酵母中表达有生物活性的XYN II并分泌到胞外。发酵液中的酶活在诱导培养60 h达到1.45 IU/mL,最适酶解温度为50℃,最适pH值为6.0。 相似文献
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《林业科学研究》2019,(6)
[目的]克隆桉树苯丙氨酸解氨酶基因(PAL),分析其序列特征及在焦枯病菌诱导下的表达特征,为探究桉树抗焦枯病机理提供理论支撑。[方法]通过SOE-PCR技术从尾细桉M1中克隆PAL基因,利用real-time PCR分析其在焦枯病菌诱导下的表达特性。[结果]克隆得到尾细桉M1 PAL基因,其ORF序列长2 142 bp,编码713个氨基酸,与其他已发表的桉树PAL相似性均在99%以上。序列分析发现,其编码蛋白是一类稳定的亲水性蛋白,含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3个磷酸化位点,二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,具有典型的苯丙氨酸和组氨酸解氨酶保守结构域。进一步分析桉树不同品系PAL基因的表达趋势,结果发现,不同品系PAL基因在焦枯病菌诱导下均表现为明显的上调表达,且抗性越强,PAL基因越早上调,上调表达量越大。[结论]从尾细桉M1中克隆得到的PAL基因具有典型的PAL家族成员特征,推测该基因可能通过参与酚类防御性物质或者信号分子SA等物质的合成,进而在桉树抵抗焦枯病菌侵染的过程中发挥重要作用。 相似文献
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肉桂酰-辅酶A还原酶(Cinnamoyl Co-A Reductase,CCR)是木质素合成中的关键酶,根据植物中CCR保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4嫩茎为材料克隆到其CCR基因,命名为Eu CCR。该基因g DNA长2 918bp,c DNA长1 045 bp,CDS区编码336个氨基酸。EuCCR核酸序列与Gen Bank已登录的桉属植物CCR基因同源性达到96%以上,与伞房属、杯果木属植物CCR的同源性达85%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整FR_SDR_e结构域及NADP结合位点和底物结合位点,与可可树等植物中CCR基因编码序列同源性也在84%以上,确定为CCR基因。对EuCCR蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析,利用MEGA软件对基因序列进行系统进化树分析。采用pQE30/M15系统对EuCCR进行原核表达,重组质粒成功表达分子量约36 kD的目的蛋白。本研究从尾叶桉GLU4中克隆得到EuCCR基因并原核表达,为该基因的酶学分析以及利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。 相似文献
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【目的】油茶种仁含油率较低且易遭逆性环境等的影响,这些都严重影响和制约了油茶产业的快速发展。丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶是脂肪酸合成酶(FASⅡ)复合体的组成酶之一,在脂肪酸合成中起着装载作用,它的酶促反应产物丙二酰单酰ACP是脂肪酸合成关键组成部分。开展该基因的功能研究,能为油茶的分子遗传育种奠定基础。【方法】以油茶品种‘华硕’种子为材料,借助其种子转录组和表达谱数据库,通过RACE技术,克隆丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶基因并对该基因进行生物信息学分析。利用常规的酶切连接技术构建基因的原核表达载体,并利用α酮戊二酸脱氢酶(KDH)偶联系统测定表达产物的酶活性。【结果】丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶基因的全长c DNA 1 867 bp,含有1 131 bp的开放读码框,编码376个氨基酸,具有58个氨基酸长度的叶绿体转运肽,该基因被命名为Co MCAT(Gen Bank登录号KJ910337)。在malonyl-Co A结合位点和ACP结合位点上分别存在高度保守的基序"GQGXQ"和"GXSXG"。原核表达载体p ET30a-Co MCAT在BL21(DE3)细胞中被成功地诱导表达,目的重组蛋白分子量约为40 k Da。酶活性分析表明,重组蛋白Co MCAT的最佳催化温度为30℃,最佳p H为7.0,比酶活性约为2.384 U·μg-1。【结论】以本实验室构建的油茶转录组数据库为基础,首次克隆获得油茶MCAT基因的全长c DNA序列,构建其原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)中成功诱导表达目的蛋白,并对重组蛋白进行初步的酶活性分析。研究结果为今后进一步深入开展和揭示油茶MCAT基因在油脂合成的代谢过程中的作用奠定基础。 相似文献
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以松墨天牛幼虫为实验材料，研究了其肠道内纤维素酶的组成和酶解动力学特征等。结果表明，松墨天牛幼虫肠道内有完整的纤维素酶系，其中以C1酶活性最强，Cx酶次之，β-1，4-葡萄糖苷酶活性最弱；C1酶、Cx酶和β-葡萄糖苷酶3者的最适作用温区分别为35～55、45～55、40～50℃，最适pH值分别为5．0、5．6、5．0；Cx酶具有最强的热稳定性(65℃，2h)，C1酶次之(55℃，2h)，β-1，4-葡萄糖苷酶最低(50℃，1h)。此外动力学参数比较揭示，C1酶具有最大的Vmax和km，分别为1．0838和0．7632，β-1，4-葡萄糖苷酶和Cx酶分别具有最小的Km(0．1832)和Vmax(0．4339)，但β-萄糖苷酶具有最大的酶解初速度(0．5938)。 相似文献