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含有核苷酸结合位点(nucleotide-binding site,NBS)和富亮氨酸重复(leucine-rich repeat,LRR)结构域的NBS-LRR类抗性基因在植物抗病防御反应中起着重要作用,启动子是调控基因表达的重要顺式元件。为研究花生(Arachis hypogaea)青枯病候选基因3(bacterial wilt candidate resistance gene 3 of Arachis hypogaea,AhBW3)表达调控机制,本研究前期克隆获得了1个青枯病抗性相关的NBS-LRR类基因,发现含有TIR结构域的全长序列(AhBW3,GenBank No.HQ637177.1)和不带TIR结构域序列(AhqBW3)的转基因烟草(Nicotiana tabacum),对青枯病的抗性响应存在差异。为研究AhBW3表达调控花生对青枯菌的响应机制,本研究利用电子克隆技术,从抗青枯病花生品种粤油92基因组DNA中克隆AhBW3基因上游1 978 bp序列,命名为pAhBW3。通过生物信息学分析发现,AhBW3含有多个TATA-box和CAAT-box等真核生物启动子核心元件,还包括根特异表达元件、光调控元件、抗逆境响应等元件。通过构建GUS融合表达载体并遗传转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),转基因拟南芥的GUS组织化学活性表达结果显示,GUS在拟南芥根部表达量最高,莲座叶的表达量亦高,在茎和花中表达量较弱,说明pAhBW3是根和叶丰富表达的启动子。通过qRT-PCR分析,显示pAhBW3调控的GUS基因能响应外源激素、干旱、高盐的胁迫,表现不同程度的上调应答。本研究为pAhBW3启动子的利用和AhBW3基因在花生的抗逆反应机制的进一步研究提供了科学依据。 相似文献
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从番茄基因组中克隆LeNCED1基因5′-侧翼1456 bp调控序列,经生物信息学分析表明,LeNCED1基因上游调控序列中存在响应昼夜节律的顺式作用元件Circadian、光响应元件Box I、逆境胁迫响应元件(TC-rich repeats)、ABA响应元件ABRE等,构建了LeNCED1基因上游调控序列与报告基因GUS融合的植物双元表达载体pLeNCED1p:GUS。 相似文献
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为探明小金海棠(Mdus xiaojinensis)类黄色条纹蛋白基因(MxYSL5)的表达和调控机制,应用Tail-PCR技术从小金海棠中克隆了翻译起始位点上游891 bp的启动子序列.生物信息学分析表明,该启动子片段中存在光响应元件、乙烯应答元件、赤霉素响应元件、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件.以GFP为报告基因,构建了含MxYSL5基因启动子的植物表达载体MxYP5-GFP.将MxYP5-GFP用基因枪法转化洋葱(Allium cepa)表皮细胞,瞬时表达结果表明,该启动子能够驱动GFP在洋葱表皮细胞中的表达,可以用于MxYSL5的表达示踪. 相似文献
4.
光合作用相关的核基因(photosynthesis-associated nuclear genes,PhANGs)可以响应包括光照、干旱、糖以及脱落酸(abscisic acid,ABA)等多种环境信号,目前己发现并报道了多种PhANGs启动子上关于光调控的顺式作用元件,但是关于干旱以及ABA等响应元件仍然缺乏系统性研究.本研究主要对核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基基因(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit,RBCS)启动子区域响应逆境胁迫的顺式作用元件进行分析.首先从中国春小麦(Triticum aestivum)基因组中分离得到TaRBCS11基因上游1 839 bp的核苷酸序列,对该启动子进行结构分析的结果表明,转录起始位点位于起始密码子上游59 bp;经PlantCARE数据库分析,发现该启动子序列上除大量保守光调控元件外(如Box Ⅰ、G-Box、I-box和GATA-motif等),还包含多种应答干旱、盐及激素等逆境因子的保守顺式作用元件(如MYB结合位点(MYB binding site,MBS)、CCAAT-box、乙烯响应元件(ethylene-responsive element,ERE)和赤霉素应答元件(gibberellin-responsive element,GARE-motif)等);从小麦基因组数据库分离得到TaRBCS11、TaRBCS13、TaRBCS10和TaRBCS14启动子序列,序列比对显示,其具有极高的同源性,同时还发现多个保守光调控元件(如MNF1、GATA-motif、I-box、G-Box和Spl)位于这4段启动子近侧区(-200bp～ATG);根据TaRBCS11启动子结构特征及调控元件分布情况,设计5条上游引物及1条下游引物用于启动子缺失片段扩增,长度分别为1 656、1 258、866、533和277 bp;随后对该启动子5’端进行缺失并构建了5个不同长度片段融合报告基因β-葡萄糖醛酸酶基因(β-glucuronidase,GUS)的缺失表达载体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的烟草(Nicotiana tabacum)叶片瞬时表达体系研究酶活变化情况.组织化学染色与酶活分析表明,光能明显提高GUS酶活,进一步分析表明,随启动子片段的缩短,启动子片段上光调控元件缺失,启动子活性依次下降;此外,对不同启动子缺失材料进行干旱、高盐、ABA、黑暗及恢复光照处理,发现干旱、高盐、ABA和黑暗均对全长启动子(P1656)有显著的抑制作用,-804～-474 bp的区域对该段启动子响应干旱及高盐胁迫具有重要作用,而参与ABA响应的核心调控区域位于-1 597～-1 198bp.本研究验证了TaRBCS11基因的表达受干旱、高盐、ABA和光调控影响,并鉴定出其启动子上参与响应非生物胁迫的重要调控区域,研究结果为今后深入研究PhANGs表达调控机制提供了重要参考. 相似文献
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AMT是介导植物铵态氮高亲和吸收的跨膜蛋白,已报道编码AMT蛋白的大部分基因的表达依赖外界氮水平和环境的调控,但调控的机制目前尚不清楚。水稻的Os AMT1;2基因在氮缺乏条件下强烈诱导表达,因此,本研究从水稻基因组DNA中PCR克隆Os AMT1;2基因上游1 940 bp的启动子序列,采用软件和试验分析Os AMT1;2启动子存在的顺式调控元件与外界氮调控的相关性。软件预测结果表明,启动子区域内除含有TATA-box和CAAT-box外,同时含有多种非生物胁迫、生物胁迫、激素响应和光响应相关的顺式作用元件,如Box-w1、MBS、Me JA、TATC和ERE应答元件。将Os AMT1;2启动子的5′端顺序删除获得5个不同缺失片段分别与GUS报告基因融合构成表达载体,通过农杆菌介导转入水稻成熟胚诱导的愈伤组织中获得转基因水稻,T1代植株水平上的GUS活性分析表明,最短启动子片段(–211 bp)能够启动GUS表达,但是GUS活性较低,对缺氮效应也不显著;中等长度启动子片段(–763 bp)的GUS活性提高,受缺氮诱导显著,且缺氮诱导不再随启动子长度增加而显著增强,说明应答氮响应的顺式作用元件位于–211 bp和–763 bp之间,非生物胁迫和激素相关的顺式作用元件多在这个区域内,是否与氮的调控存在相关性有待后续进一步证明。 相似文献
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玉米In5-2启动子功能区域在洋葱瞬时表达系统中的分析 总被引：3，自引：0，他引：3
本研究旨在通过对根癌农杆菌侵染洋葱表皮细胞的条件进行优化,从而建立一种新的瞬时表达系统,并将其应用于玉米In5-2启动子的功能区域的分析中,明确In5-2启动子的乙酰苯胺类化合物诱导元件的具体位置.在本研究中采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染洋葱(Allium cepa)表皮细胞,对转β-葡糖醛酸酶(GUS)基因的瞬时表达进行研究,并分析了侵染液中乙酰丁香酮(As)的浓度、侵染时间、菌液浓度、共培养时间对GUS基因的瞬间表达的影响.结果显示,在OD600值为0.8的农杆菌液中感染15 min,共培养3 d,能够得到较高的GUS基因瞬间表达,从而建立了一种新的瞬间表达系统.同时,构建了含不同长度的玉米(Zea mays)In5-2启动子片段缺失载体,利用新的瞬时表达系统分析其功能区域,推测出乙酰苯胺类化合物诱导元件位于ATG上游-220～-143 bp之间.结果表明新的瞬时表达系统可以快速有效地进行启动子的分析. 相似文献
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SEP（SEPALLATA）类基因属于花器官发育ABCDE模型中的E类基因,拟南芥中的研究表明该类基因可能具有控制花器官形态发育以及激活其它类型基因的功能,是一类花发育过程中的关键基因。因此,研究杨树SEP类基因启动子表达特性对于杨树的开花调控研究具有重要意义。本文根据毛白杨SEP3基因和毛果杨基因组序列设计引物,通过PCR获得了PtSEP3-1,基因上游2000bp的序列。序列分析结果表明该序列具有启动子的基本元件TATA—box和CAAT-box,还包含大量光响应元件ACE、BoxI和Box4等,此外还有脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件GARE—motif以及胁迫响应元件HSE、TC—richrepeats等。进一步构建了一个以PtSEP3-1启动子驱动GUS基因的植物表达载体pPtSEP3-1,protest,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。 相似文献
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甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)是糖酵解过程中的关键酶。作为GAPDH的亚型,GAPC(cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸,但是关于GAPC在非生物胁迫应答中作用的研究却并不充分。本研究从中国春小麦(Triticum aestivum)中克隆出了TaGAPC1基因(GenBank No. KU246046),其编码337个氨基酸,并克隆出基因上游973 bp的序列,将其命名为P973。通过融合绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因,使用基因枪法瞬时转化洋葱(Allium cepa)表皮细胞进行亚细胞定位,结果显示TaGAPC1蛋白定位于细胞膜上。使用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技术,分析TaGAPC1基因在根、茎、叶中,以及干旱(PEG8000)、盐(NaCl)、脱落酸(abscisic acid, ABA)和低温(4℃)非生物胁迫下的表达模式。结果表明TaGAPC1基因在叶、根、茎中的表达量依次下降,在PEG8000、NaCl和ABA胁迫下的表达量显著上升,但对4℃的响应不明显。根据PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)数据库分析,P973启动子序列中包含响应干旱、ABA、低温和创伤等胁迫的顺式作用元件,如干旱应答元件(drought-responsive element,DRE)、激素应答元件包括ABA应答元件(ABA-responsive element, ABRE)、MYB结合位点(MYB-binding site, MBS)和WUN-motif等。根据顺式作用元件的分布,扩增得到5个启动子5'端缺失片段,分别命名为P844、P738、P605、P475和P256。构建6条启动子序列融合β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase, GUS)的表达载体,并瞬时转化烟草(Nicotiana batacum)植株,测定PEG8000、NaCl、ABA和4℃胁迫下各启动子驱动的GUS酶活。结果表明,-973~-605启动子区域在TaGAPC1基因应答PEG8000和NaCl胁迫中具有关键作用,-973~-475启动子区域对应答ABA胁迫至关重要。本研究从分子水平初步阐释了TaGAPC1与非生物胁迫应答的关系,为深入探讨其抗逆的分子机制奠定了基础。 相似文献
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陈悦陈茜董伟峰才晓溪沈阳杨珺凯贾博为孙明哲孙晓丽 《土壤与作物》2022,(2):159-169
提高水稻耐冷性对保障水稻高产、稳产具有重要意义。AP2/ERF转录因子能够抵抗外界逆境胁迫,课题组前期研究发现水稻OsERF096基因显著受冷胁迫诱导表达。本研究克隆了OsERF096启动子序列(-1~-1215 bp),通过软件预测发现OsERF096启动子中含有多个与低温及激素响应相关的顺式作用元件。根据元件分布特征进行了5′端片段缺失设计,构建了GUS表达载体P_(OsERF096-1215)-GUS、P_(OsERF096-1102)-GUS、P_(OsERF096-827)-GUS、P_(OsERF096-501)-GUS,并转化拟南芥。通过GUS染色和GUS基因qRT-PCR检测发现,正常生长条件下,4个不同长度的启动子中P_(OsERF096-1215)启动子活性最高,P_(OsERF096-1102)最低。与前期qRT-PCR检测不同,冷处理下OsERF096启动子活性未发生显著变化。这些结果为后续OsERF096基因的表达调控及生物学功能研究奠定重要基础。 相似文献
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为了研究拟南芥扩张蛋白AtEXPA1基因启动子上与转录调控有关的元件,我们通过PCR技术克隆了AtEXPA1基因上游897bp具有启动子活性的序列,再将启动子作不同程度截短,所有片段与GUS基因融合,构建植物表达载体,采用基因枪轰击拟南芥叶片和PEG介导转化烟草原生质体,通过定性和定量检测GUS的活性,发现在靠近翻译起始密码子的上游144bp之间存在增强转录活性的元件。将PEG介导转化的烟草原生质体,分别进行光诱导,冷诱导, 脱落酸（ABA）,盐处理,根据GUS定量检测的结果,推测（1）在AtEXPA1基因启动子上广泛存在与光调控有关的元件,（2） -897～-626 bp之间存在冷负调控元件, （3）-626～-444 bp之间存在与ABA负调控有关的元件,（4）-626～-282 bp之间存在与盐负调控有关的元件。 相似文献
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为研究BrABF1基因在不结球白菜中的表达模式并探索其在开花调控中的作用,本研究以不结球白菜苏州青品种为试验材料,通过同源克隆获得BrABF1基因序列,对其氨基酸序列进行比对和进化分析,利用亚细胞定位技术研究BrABF1的空间表达,采用β-D-葡糖醛酸酶(GUS)染色方法研究BrABF1在植物中的表达模式,利用PlantCARE在线软件预测BrABF1基因的启动子的顺式作用元件。构建植物表达载体pEarlyGate101-BrABF1-YFP转化拟南芥,统计野生型和转基因拟南芥植株的开花时间。结果表明,BrABF1基因含有1 104 bp开放阅读框(ORF),编码367个氨基酸。BrABF1与甘蓝型油菜和野甘蓝(原变种)同源性最高,进化关系最近。BrABF1定位在细胞核上。BrABF1启动子驱动的GUS蛋白主要在拟南芥的叶脉中特异性表达。BrABF1启动子序列包含大量的顺式作用元件,如光响应元件、植物激素响应元件、低温响应元件和逆境胁迫响应元件等。转基因拟南芥植株开花时间晚于野生型,表明BrABF1基因能抑制植物的开花。本研究结果为提高不结球白菜商品价值提供了理论基础。 相似文献
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采用高保真PCR技术从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）基因组中分离了β-肌动蛋白（β-actin）基因片段（GenBank登录号：EF026001）。序列分析显示该片段包括长为1643bpβ-actin基因5＇端侧翼区的启动调控区和90bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为108bpβ-actin基因上游调控序列、β-actin基因不翻译的第1个外显子和第1个内含子。上游调控序列中含有与转录活性密切相关的作用元件：CAAT box,TATA box和CArG box,分别位于转录起始位点上游的-92、-29和-62处。将尼罗罗非鱼β-actin基因的启动调控区定向克隆到不含启动子的红色荧光表达载体pDsRed2-1中,构建了重组荧光表达载体。重组载体经EcoRⅠ线性化后,采用显微注射技术将其注射到唐鱼（Tanichthys albonubes）的受精卵中,利用荧光显微镜观察外源基因增强型红色荧光蛋白基因（DsRed2）在唐鱼中的表达。结果表明,在荧光显微镜下以及普通解剖镜下均可观察到红色荧光,说明本实验分离到的罗非鱼β-actin基因启动子序列具有有效的驱动功能。 相似文献
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为丰富花生种子特异启动子资源,本研究利用PCR技术在花生基因组中克隆了种子贮藏蛋白基因PSC32的启动子AHSSP1,利用半定量RT-PCR检测了PSC32基因表达模式,借助NewPLACE在线分析了AHSSP1序列中存在的顺式作用元件,并构建了AHSSP1驱动GUS报告基因的表达载体,经农杆菌转化获得转基因拟南芥,经GUS组织化学染色鉴定了该启动子的功能。结果表明,PSC32基因957 bp长的启动子AHSSP1序列具备种子特异表达启动子特有的3个RY REPEAT元件。半定量RT-PCR分析发现,PSC32基因在花生成熟种子中表达,而在饱果成熟期根、茎、叶片、花、入土前的果针、成熟种子的果壳中均不表达。GUS组织化学染色发现,转基因拟南芥成熟种子以及萌发种子的子叶、下胚轴和胚根均能够被染上蓝色;长出真叶后,子叶和下胚轴仍能被染色,而根和真叶不能被染上蓝色;成年期转基因拟南芥的叶片也不能被染上蓝色。而野生型拟南芥整个生长时期均不能被染上蓝色。以上现象说明AHSSP1是一个种子特异启动子。本研究丰富了花生种子特异启动子的资源,对花生籽仁品质改良或以花生籽仁作为“生物反应器”的研究具有重要的应用价值。 相似文献
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3-磷酸-甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)广泛地存在于各种生物体内,是生物体内糖异生和糖酵解过程中的关键酶。为了获取长武134小麦(TriticumaestivumL.)GAPDH上游序列并分析其启动子活性,本研究根据小麦GAPDH基因(GenBank登录号:EF592180.1)5'端序列设计特异引物,利用基因组步移法获得了该基因上游1071bp的序列;对该序列进行结构分析表明,转录起始位点可能位于起始密码子上游约700bp处;PlantCARE预测瞬时作用元件表明,在翻译起始密码子ATG的上游含有启动子基本结构元件TATA-box、CAAT框,以及能够应答脱落酸(abscisic acid,ABA)、干旱、低温等非生物胁迫逆境因子的多种顺式作用元件(如MYB、MYC、WRKY、ABRE、HSE和GT-1等);然后用GAPDH基因启动子序列替换植物表达载体pBI121GUS基因前的CaMV35S启动子,并构建启动子融合表达载体,并通过农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105介导转化烟草(Nicotianatabacum)叶盘进行了瞬时表达分析,以GUS作为报告基因研究在ABA、干旱、低温3种非生物胁迫下启动子的活性。结果显示,ABA、低温和干旱对启动子有较明显的诱导效应,其中以干旱诱导最为显著。本研究通过基因组步移克隆得到GAPDH基因的启动子,分析表明此启动子为有着强启动活性的诱导型启动子。 相似文献
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采用高保真PCR技术从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）基因组中分离了β-肌动蛋白（β-actin）基因片段。序列分析显示该片段包括长为1643bp的β-肌动蛋白（β-actin）基因5,端侧翼区的启动调控区和90bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为108bp的β-actin基因上游调控序列、β-actin基因不翻译的第一个外显子和第一个内含子。上游调控序列中含有与转录活性密切相关的作用元件：CAAT Box,TATA Box和CArG Box,分别位于转录起始位点上游的-92,-29,-62处。将尼罗罗非鱼β-actin基因的启动调控区定向克隆到不含启动子的红色荧光表达载体pDsRed2-1中,构建了重组荧光表达载体。重组载体经EcoRⅠ线性化后,采用显微注射技术将其注射到唐鱼的受精卵中,利用荧光显微镜观察外源基因增强型红色荧光蛋白基因（DsRed2）在唐鱼中的表达。结果表明在荧光显微镜下以及普通解剖镜下均可观察到红色荧光,说明本实验分离到的罗非鱼β-actin基因启动子序列具有有效的驱动功能。该实验为下一步进行转自源基因尼罗罗非鱼的研究奠定了基础。 相似文献
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从番茄基因组中克隆LeNCED1基因5'-侧翼1456 bp调控序列,经生物信息学分析表明,LeNCED1基因上游调控序列中存在响应昼夜节律的顺式作用元件Circadian、光响应元件BoxⅠ、逆境胁迫响应元件(TC-rich repeats)、ABA响应元件ABRE等,构建了LeNCED1基因上游调控序列与报告基因GUS融合的植物双元表达载体pLeNCED1p:GUS. 相似文献
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根据Genbank中挪威鼠（Rattus norvegicus）Hspa4基因序列(登录号：NM 153629)和玉米Ubi-1启动子序列(登录号：DQ141598 )设计引物,采用RT-PCR和PCR技术分别进行克隆。测序及同源性分析结果表明：Hspa4基因片段含有2530bp,编码840个氨基酸;获得的启动子Ubi-1序列大小为1992bp;克隆的序列与相应原序列同源性分别为99.96％和99.55%。以植物表达载体pCAMBIA1301质粒为基础,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1301-Ubi-Hspa4,为利用Hspa4基因改良植物抗逆性打下了基础。 相似文献
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摘要： 利用PCR技术获得6个不同长度的玉米In5-2启动子5'端缺失片段，分别克隆到植物表达载体p1301后转化烟草。GUS活性定量检测结果显示，玉米In5-2的基础转录区域可能位于ATG上游-1 520~-1 431 bp之间。利用DNAMAN软件分析在-1 108~-1 079 bp和-891~-864 bp之间存在着2个茎环结构，推测茎环结合蛋白位点可能位于-1 079~-897 bp之间，且ATG上游-388~-86 bp之间可能存在乙酰苯胺类化合物诱导元件。 相似文献
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马铃薯光诱导型茎叶特异表达启动子ST-LS1的克隆与功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
叶片是植物光合作用器官,在能量固定和利用中具有重要作用,研究光诱导型茎叶特异表达启动子的作用元件及其功能对于其调控基因的表达研究具有重要的理论意义和应用价值。本研究用PCR技术从马铃薯(Solanum tuberosum L.)基因组中分离了光诱导型茎叶特异表达启动子ST-LS1的1556bp序列,序列分析表明,该片段与已报道的ST-LS1启动子(Gen Bank accession No.X04753.1)有99.68%的同源性,包括参与芽的特定表达和光反应顺式作用元件as-2-box、光效应顺式作用元件G-box等。将该片段与GUS基因融合,构建了植物表达载体pBⅠ121-ST-LS1,应用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)获得了转基因植株。用qRT-PCR和GUS活性组织染色检测转基因烟草植株,结果表明,在ST-LS1启动子驱动的GUS转基因烟草植株的叶和茎中能够检测到GUS基因的表达,根中则检测不到;对黑暗、恒温光照培养、自然光条件处理20d后的转基因植株分析表明,在黑暗处理的转基因植株中GUS基因无表达,而在自然光条件处理转基因植株的叶和茎中GUS基因的表达高于恒温光照培养的转基因植株。结果可为应用基因工程改良农作物品种提供理论和应用依据。 相似文献